干貨分享 | ELISA方法學(xué)開發(fā)實(shí)踐里，不可不知的親和力測定方法開發(fā)

上期小奧課堂和大家講了《ELISA方法學(xué)開發(fā)實(shí)踐版-生物大分子檢測的定量方法開發(fā)》。
本期小奧再和大家分享另一個重要話題：《ELISA方法學(xué)開發(fā)實(shí)踐版-親和力測定方法開發(fā)》。

一、前言

目前用于測定受體配體間的親和力，也就是解離平衡常數(shù)的方法，主要有：

1. 熱力學(xué)測定方法
2. 動力學(xué)測定方法
3. 飽和濃度法

其中動力學(xué)測定方法和飽和濃度法較為通用：動力學(xué)測定方法（如Biacore）涉及到比較昂貴的儀器投入，飽和濃度測定法為國內(nèi)絕大多數(shù)生物藥物企業(yè)常用的測定方法。

ELISA用于親和力的測定是飽和濃度測定法的主流模式，常用于抗原蛋白或者抗體的蛋白水平的活性評估和抗體的長期穩(wěn)定性評價等。
ELISA用于親和力測定往往沒有商業(yè)化的試劑盒，需要實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)。

由于生物技術(shù)這方面教育缺失和新藥研發(fā)企業(yè)在此應(yīng)用的積累不夠，一個能夠通過方法學(xué)驗(yàn)證的ELISA親和力測定方法對于很多從業(yè)人員來說是一件難度較大的事情，而且很有可能出現(xiàn)謬誤如新號傳遞錯誤或者偏差等。
其中最大的一個謬用是采取ELISA定量的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行ELISA親和力測定方法的開發(fā)。

本文從親和力的測定方法的基本原理入手，描述飽和濃度法親和力測定的基本原則，概述ELISA方法開發(fā)過程中的抗原抗體的劑量關(guān)系，以及在ELISA用于親和力測定方法應(yīng)用時可能會出現(xiàn)的幾個錯誤，并為大家介紹通用的親和力測定的方案和初步的方法學(xué)開發(fā)的方案。

二、親和力基本概念

我們通過分析幾個化學(xué)反應(yīng)案例，和大家解釋一下什么叫做親和力。

 例子A 
氫氣和氧氣在點(diǎn)燃的條件下生成水。
在反應(yīng)停止時，如果在反應(yīng)環(huán)境中氫氣的摩爾濃度恰巧是氧氣的摩爾濃度的2倍時，兩者皆被消耗，反應(yīng)環(huán)境中只有水；如果氫氣的摩爾濃度大于氧氣的摩爾濃度的2倍時，氧氣被消耗，反應(yīng)環(huán)境中只有氫氣和水；果氫氣的摩爾濃度小于氧氣的摩爾濃度的2倍時，氫氣被消耗，反應(yīng)環(huán)境中只有氧氣和水。
這是關(guān)于化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)知識，化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的結(jié)果，反應(yīng)物能夠完全變?yōu)樯晌铮捶磻?yīng)能進(jìn)行到底，有此類反應(yīng)的過程和結(jié)果特性的反應(yīng)稱之為不可逆反應(yīng)。

 例子B 
PD1抗原（CD279）和PD1抗體（如pembrolizumab）在常溫常壓下反應(yīng)。
在反應(yīng)停止時，如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為200nM, pembrolizumab的摩爾濃度是100nM時，在理想條件下pembrolizumab-CD279復(fù)合物的濃度為97.86nM, CD279的摩爾濃度為4.28nM, pembrolizumab為2.14nM; 
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為100nM, pembrolizumab的摩爾濃度是200nM時，在理想條件下pembrolizumab-CD279復(fù)合物的濃度為49.81nM, CD279的摩爾濃度為0.38nM, pembrolizumab為159.19nM。

 例子C 
PD1抗原（CD279）和PDL1抗原（CD274）在常溫常壓下反應(yīng)。
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為200nM, CD274的摩爾濃度是100nM時，在反應(yīng)完成時理想條件下CD274-CD279復(fù)合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為197.65nM，CD274的摩爾濃度是97.65nM；
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為100nM, CD274的摩爾濃度是200nM時，在反應(yīng)完成時理想條件下CD274-CD279復(fù)合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為97.65nM，CD274的摩爾濃度是197.65nM，絕大多數(shù)CD279和CD274并未參與反應(yīng)。
案例B、C兩種情況下，無論是抗原和抗體（配體和受體）結(jié)合反應(yīng)，兩者反應(yīng)有生成復(fù)合物的正反應(yīng)過程，也有復(fù)合物解離反應(yīng)生成抗原、抗體逆反應(yīng)過程，最終的結(jié)果是抗原，抗體和抗原-抗體復(fù)合物三者共存的狀態(tài)。

這樣的反應(yīng)稱之為可逆反應(yīng)。
當(dāng)一個可逆反應(yīng)中正反應(yīng)和逆反應(yīng)的速度相等時，反應(yīng)體系中抗原的濃度、抗體的濃度和抗原-抗體復(fù)合物濃度不再增加也不再減少，可逆反應(yīng)完成，反應(yīng)體系中各成分摩爾濃度處于動態(tài)平衡。

親和力(Affinity)是可逆反應(yīng)過程中抗原、抗體和抗原-抗體復(fù)合物之間的相對狀態(tài)的特征參數(shù)，其更加專業(yè)性和術(shù)語化的名稱是解離平衡常數(shù)KD，單位mol/L(和濃度單位一致)。

親和力數(shù)值越小則親和力越強(qiáng)，親和力的強(qiáng)弱決定了最終決定反應(yīng)完成時可逆反應(yīng)各組分相對多少。

如例子B和C同樣是和200nM CD279（PD1）反應(yīng)，抗體pembrolizumab (PD1抗體)相對于CD279的親和力為0.4nM, 配體CD274（PDL1）相對于CD279的親和力為8200 nM,最終反應(yīng)生成的pembrolizumab-CD279復(fù)合物是97.86 nM,而CD274- CD279復(fù)合物僅僅只有2.35nM，兩者相差42倍。

有別于不可逆反應(yīng)，除了抗原抗體的摩爾濃度外，抗原和抗體（配體和受體）兩者間的親和力將極大的影響可逆反應(yīng)中生成物的多少。

三、你知道ELISA進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)時的基本原則嗎？

對于親和力測定方法和原理的概述，讀者可參考生物功能學(xué)篩選評價技術(shù)之親和力評價篇。
本文主要對飽和濃度法進(jìn)行概括。
R代表受體或抗原，L代表配體或抗體。
采用飽和濃度法，如果要測定配體相對于受體的親和力，少量R存在的情況下，將L進(jìn)行梯度稀釋，檢測R-L復(fù)合物的濃度，當(dāng)R-L復(fù)合物的濃度占總R濃度的一半時，L對應(yīng)的濃度值（EC50）即L相對于R的KD值。
RL復(fù)合物/R即B值可用檢測的信號值代替，梯度稀釋的L和信號之間的函數(shù)關(guān)系滿足下面的公式，只有在此在特定的實(shí)驗(yàn)條件下EC50值能夠等價于KD值。
飽和濃度法測定KD值有幾個關(guān)鍵點(diǎn)，即相互作用的兩個分子，R要少量，L要進(jìn)行連續(xù)的梯度稀釋，需要得到最大的信號響應(yīng)值（所有的R的結(jié)合位點(diǎn)被L占據(jù)）即平臺期，那么在此條件下，占據(jù)一半R時，所需要的L濃度（EC50）為KD值。
飽和濃度法主要測定的是代表RL復(fù)合物的信號值，測定方法可以是流式細(xì)胞術(shù)、同位素標(biāo)記術(shù)、熒光偏振，也可以是ELISA。

四、用于親和力測定的ELISA方法學(xué)開發(fā)常用方法

布局

一般操作流程

01 酶標(biāo)板的制備：取濃度為100 ug/ml抗原，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加樣布局表加入100ul/孔，分別加入酶標(biāo)板條中(Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的空白對照，2-8℃過夜；
02用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ul/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時；洗滌液洗板3次，拍干待用；
03 按照布局將抗體以100000ng/ml起始3倍梯度稀釋（Note 3），按照布局，100ul/孔加入微孔板中；
04放入奧豪斯微孔板振蕩器 (ISLDMPHDG)內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時；  

05用洗滌液洗板3次，拍干；
06酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯渦旋儀（VXMNFS）上混勻，100ul/孔；

07放入微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時；    
08用洗滌液洗板4次，拍干；
09取酶聯(lián)抗體對應(yīng)的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；
10使用8道排槍以100 ul/孔加入顯色液；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘 （Note 5）；
12使用8道排槍以100 ul /孔加入終止液終止反應(yīng)（根據(jù)底物的不同，此步驟可能不需要）；
13用酶標(biāo)儀測定信號值（Note 6）；
14結(jié)果分析（Note 7）。 

貼心小NOTE

Note1：如果需要減少反應(yīng)過程中高濃度的抗體（100000ng/ml）對酶標(biāo)板材的非特異吸附，在包被過程中，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,包被的抗原濃度需要少量0.2-1ug/ml，具體情況需要根據(jù)抗原抗體的親和力大小來進(jìn)行判斷優(yōu)化。一般來說親和力越強(qiáng)，所需的抗原包被濃度越低。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學(xué)開發(fā)的初期可以拉大一下標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍100000ng/ml-0.1ng/ml，以得到有明顯上下平臺期的全曲線，當(dāng)抗原抗體間親和力較強(qiáng)時，梯度濃度可縮小，稀釋的倍數(shù)可在方法學(xué)優(yōu)化過程中縮小至2倍。
Note4：酶聯(lián)抗體效應(yīng)過量，酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進(jìn)行比較選擇，對于單抗成分的酶聯(lián)抗體，如果高低兩個稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號傳遞未產(chǎn)生偏差。
對于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜，可以初略計(jì)算下酶聯(lián)抗體的摩爾濃度要高于包被上的抗原摩爾濃度的5倍以上。當(dāng)酶聯(lián)抗體濃度較小時，酶聯(lián)抗體在高劑量不同濃度的抗體條件下均被抓到，曲線有假上平臺。
Note5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號值和顯色時間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認(rèn)檢測儀器的信號線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時應(yīng)控制信號值不要超過3，當(dāng)信號值超過線性范圍時，曲線有假上平臺。
Note6：不同底物需要用不同的儀器進(jìn)行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學(xué)發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。
Note7：標(biāo)準(zhǔn)的劑量曲線擬合一般用四參數(shù)擬合，需要有明顯的上下平臺期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之間，EC50（C值）即為抗體相對于抗原的親和力值。

五、總結(jié)

根據(jù)飽和濃度法，采用ELISA進(jìn)行親和力測定時，需要有明顯的四參數(shù)S型曲線，即需要有隨抗體濃度漸進(jìn)變化的信號曲線。
在抗體低濃度和高濃度時有明顯的上下平臺期，上平期信號值的一半對應(yīng)的抗體濃度（EC50）值即抗原抗體間親和力KD值。
由于儀器的檢測信號的線性范圍是有限，當(dāng)信號超過線性范圍時會使曲線進(jìn)入假上平臺期使得測得的親和力不準(zhǔn)。
包被的抗原濃度直接決定了信號的最大信號值，所以在用ELISA進(jìn)行親和力測定時，包被的抗原濃度盡量要小，以得到合適的信號值；酶聯(lián)抗體濃度過低時也可能使曲線進(jìn)入假平臺期。

在ELISA方法學(xué)開發(fā)過程中，酶聯(lián)抗體過量以保證信號的線性傳遞需要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
當(dāng)信號無法得到有效的上平臺期時，說明抗原抗體間的親和力太弱或者包被抗原過多，需要更大濃度的抗體才能使得所有抗原被完全抓住以達(dá)到平臺期。
受限于ELISA靈敏度的限制，在一些親和力較弱（>100nM）的抗體抗原中，采用ELISA方法基本得不到有效的平臺期，也無法測得準(zhǔn)確的親和力數(shù)值。
ELISA進(jìn)行親和力測定評價抗原的活性或者測定抗體活性時，得到的EC50并非越小越好，信號進(jìn)入假平臺期（達(dá)到儀器的檢測極限，酶聯(lián)濃度較小）均會使EC50變小，從而得到錯誤的親和力數(shù)據(jù)，這也是ELISA進(jìn)行親和力測定時最容易產(chǎn)生的謬誤。
如今很多抗原蛋白的供應(yīng)商關(guān)于抗原活性的評價均存在此類謬誤。

抗原和抗體間的親和力是有兩者的結(jié)構(gòu)和相互作用決定的，可能是0.1 nM,1 nM或者1000 nM。評價ELISA親和力測定方法的好壞需要看此EC50值是否和親和力的值相符，親和力的值可通過熱力學(xué)測定方法，動力學(xué)測定方法和飽和濃度法中的細(xì)胞流式測定法等多方面驗(yàn)證。
反過來說當(dāng)一個ELISA方法不存在諸如信號進(jìn)入假平臺期（達(dá)到儀器的檢測極限，酶聯(lián)濃度較?。?/span>等謬誤時，其EC50值才能真實(shí)的反應(yīng)親和力的數(shù)值。

采用ELISA進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)需要明確應(yīng)用目的，大分子定量和親和力測定。
不同的應(yīng)用目的，抗原和抗體的相對劑量濃度會有很大的差異，有不同的劑量曲線，讀者可以結(jié)合上篇《ELISA方法學(xué)開發(fā)實(shí)踐版-生物大分子檢測的定量方法開發(fā)》進(jìn)行對比研究，明晰差異。

本期分享就到這里啦，我們下期再會喲！

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