醋酸纖維素膜電泳裝置實(shí)驗(yàn)原理簡介

醋酸纖維素膜電泳裝置(全套配置: QC-A型醋酸纖維素膜電泳槽+DYY-6C型穩(wěn)流穩(wěn)流電泳儀或KYC-600C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源)主要用于分離和鑒定血清蛋白等生物材料，該產(chǎn)品已在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中普遍使用。

一 操作

1、 醋酸纖維薄膜的預(yù)處理

A 在膜片的無光澤面上用鉛筆輕輕地畫一條加樣線。加樣線可選在距膜片一端2CM處。

B 在一培養(yǎng)器內(nèi)裝入電極緩沖液，將膜片小心地浮鋪在電極緩沖液面上，一般是將膜片的無光澤面朝下。膜片的底面吸收電極緩沖液后便逐漸下沉，直至電極緩沖液將膜片完全浸沒。

C 待膜片在電極緩沖液內(nèi)浸透數(shù)分鐘后，用鈍頭鑷子取出，夾在兩層濾紙之間以吸去多余的電極緩沖液，但不可過干。

D 在膜片無光澤面的加樣線上進(jìn)行加樣，通常作線形加樣，不作點(diǎn)狀加樣。用印模（長15mm，寬3mm的有機(jī)玻璃）蘸取血清蛋白樣品“印蓋”在加樣線上。印蓋時(shí)，注意印模兩端到膜片邊緣之間的距離基本相等。

E 樣品的加樣量或加樣體積隨樣品的濃度，染色和檢定方法等條件的不同而有較大的變化，通常每條加樣線上加0.5mg蛋白質(zhì)樣品的量，如印蓋一次不足量，可在原位再印蓋一次。

F 用鈍頭鑷子將加過樣的膜片安放在電泳槽膜支架上，膜片兩端約10mm的部分與支架的頂面緊貼，醋酸纖維素膜依靠自身在電極緩沖液中的粘著力會(huì)緊繃在電泳槽兩端的膜支架上。在同一電泳槽內(nèi)同時(shí)安放幾張膜片，相鄰膜片之間應(yīng)相距3mm以上。

G 在電泳槽的兩個(gè)電極室內(nèi)注入適量的電極緩沖液，用長40mm濾紙2~3層作搭橋，濾紙條一端與支架前沿對(duì)齊，另一端侵入電泳槽的緩沖液。待濾紙條濕潤后，去除氣泡，使濾紙緊貼于支架上。

H 用鈍頭鑷子將加過樣的膜片安放在電泳槽的支架上，加過樣的一端平貼在負(fù)極端支架，另一端平貼在正極端支架，呈繃狀態(tài)。

I 蓋上電泳槽蓋，讓膜片在電泳槽內(nèi)水平靜置平衡10分鐘。然后將電泳槽的兩個(gè)電極與電泳儀直流電源的正負(fù)極分別相接。

J 通上電源讓電泳儀工作在穩(wěn)壓狀態(tài)，電壓調(diào)至120~160V，相當(dāng)于電場強(qiáng)度為15~20V/cm，也可讓電泳儀工作在穩(wěn)流狀態(tài)，電流強(qiáng)度視膜片多少而定，一般每厘米膜寬電流強(qiáng)度控制在0.4~0.8mA。電泳時(shí)間50~70min。

K 醋酸纖維素膜電泳通常在室溫下進(jìn)行。提高電場強(qiáng)度，可加快電泳速度。但在單位時(shí)間內(nèi)膜上產(chǎn)生的熱量也越高，導(dǎo)致緩沖液的大量蒸發(fā)，所以需要有效地冷卻，避免膜片干燥。通常在冷卻槽里放置自來水，冷鹽水和冰塊不斷冷卻。

L 電泳完畢。

M 將膜片浸入為止。

N 注意事項(xiàng)

     膜片電泳前的預(yù)處理

       醋酸纖維素膜對(duì)水的親和力比紙小，電泳時(shí)要保證膜片上含有一定量的緩沖液，必須預(yù)先將膜片在緩沖液中浸透。浸膜的正確方法應(yīng)該是將膜片小心地浮鋪在緩沖液的表面上，依靠膜片的底面逐漸吸收緩沖液然后下沉到緩沖液中。如果一開始就將膜片全部浸沒，膜片上會(huì)聚集許多小空氣泡從而形成許多不透明的斑點(diǎn)，這就需要很長時(shí)間才能將膜片浸透，不僅浪費(fèi)時(shí)間而且影響以后的分離效果。此外，膜片浸透后用濾紙吸去多余的緩沖液時(shí)既不能吸得太干也不能過濕。太干，不利于電泳分離；太濕，會(huì)影響加樣，使樣品線條擴(kuò)散變寬，電泳時(shí)各組分的起始點(diǎn)參差不齊，從而影響分離效果。

2 、電極緩沖液濃度的選擇

   常用的pH8.6巴比妥緩沖液，其濃度一般都是在0.05mol/L到0.09mol/L之間進(jìn)行選擇的。選擇時(shí)，先初步定上某一濃度，例如電泳槽內(nèi)兩極之間的膜條長度為8~10cm，每厘米膜長需要有電壓25V，電流強(qiáng)度要求每厘米膜寬為0.4~0.5mA。如果電泳時(shí)達(dá)不到或超過這個(gè)值，就應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過低，所造成的影響是區(qū)帶移動(dòng)速度過快、區(qū)帶寬度增大；緩沖液濃度過高，會(huì)使區(qū)帶移動(dòng)速度過慢，從而導(dǎo)致某些分離區(qū)帶過于集中不易分辨。需要特別指出的是，在醋酸纖維素膜電泳中，由于電流的大部分是由樣品傳導(dǎo)的，因此會(huì)產(chǎn)生很多的熱。有時(shí)所選擇的緩沖液濃度認(rèn)為是比較合適的，但是在環(huán)境溫度升高或使用較高的電壓的情況下，水份的熱蒸發(fā)作用加劇，也可造成緩沖液濃度過高，甚至使膜片干涸的后果。

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