如何優(yōu)雅的完成噬菌體的擴增和定量實驗？實驗汪必備！ | 小奧課堂

開學(xué)季又到了實驗汪又要去“搬磚”了
如何優(yōu)雅的搬磚還不用求助師兄師姐

當(dāng)然是關(guān)注“小奧課堂”欄目啦

今天小奧為各位介紹的
是一篇干貨滿滿的 
噬菌體展示方法實踐手冊 
“噬菌體的擴增與定量”

 這是一份難得的學(xué)霸筆記
請收好（收藏）！ 

Part 1

雜交瘤、單細(xì)胞克隆和噬菌體展示技術(shù)是抗體發(fā)現(xiàn)的三種主流技術(shù)，其中噬菌體展示技術(shù)作為諾獎級別的技術(shù)，在生物創(chuàng)新醫(yī)藥研發(fā)過程中有著十分重要的作用，極大的加快了抗體類藥物研發(fā)的進程。噬菌體展示技術(shù)不僅在新的抗體和多肽的發(fā)現(xiàn)及優(yōu)化過程中有著核心的作用，還能和傳統(tǒng)的動物免疫技術(shù)相結(jié)合，與納米抗體、全人源轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)平臺進行有效對接，能夠廣泛用于抗體、抗體偶聯(lián)藥物和CAR-T/TCR-T等領(lǐng)域。本文將針對噬菌體展示技術(shù)的噬菌體增殖和擴增實驗細(xì)節(jié)進行探討、分享具體實驗過程的經(jīng)驗，以其原理為根本來指導(dǎo)實驗過程，以精益求精的實驗過程，增加噬菌體展示技術(shù)在抗體發(fā)現(xiàn)過程中的成功率。

Part 2 

——噬菌體文庫 
 擴增及展示的基本原理 | 

現(xiàn)在普遍應(yīng)用的噬菌體展示抗體片段的體系稱之為“3+3體系”（3為噬菌體的p3衣殼蛋白）；3+3代表著p3衣殼蛋白有兩個來源：

• 噬菌粒（phagemid）
• M13KO7輔助噬菌體(Helper Phage）

菌粒（phagemid）上的p3蛋白融合了抗體片段的基因，是文庫多樣性的關(guān)鍵；輔助噬菌體(Helper Phage)上的p3蛋白為噬菌體天然的p3蛋白。
*噬菌粒是一種比較小的質(zhì)粒載體，在大腸桿菌感受態(tài)中有較高的轉(zhuǎn)化效率，并且能夠在大腸桿菌中擴增。

含有噬菌粒的大腸桿菌被輔助噬菌體(Helper Phage)感染后，會利用大腸桿菌的酶系統(tǒng)、原料和能量進行擴增,最終包含噬菌粒的噬菌體從大腸桿菌釋放出來，該子代噬菌體的p3衣殼蛋白會展示抗體片段。

Part 3

 ——在噬菌體擴增過程中 
 遇到的難題和對應(yīng)的解決方案 | 

噬菌體的建庫過程實際上是抗體片段基因多樣性的傳遞過程：
從血樣中抗體基因的多樣性傳遞到噬菌粒的過程，是噬菌粒文庫構(gòu)建的內(nèi)容；
從噬菌粒的多樣性傳遞到含有噬菌粒的大腸桿菌的多樣性，是噬菌粒質(zhì)粒電轉(zhuǎn)大腸桿菌的內(nèi)容；
從含有噬菌粒的大腸桿菌的多樣性傳遞到噬菌體的多樣性則是噬菌體擴增的內(nèi)容，也是本文實驗經(jīng)驗關(guān)注的問題。

噬菌體的擴增最終目的是將噬菌粒中單一拷貝的抗體片段基因通過噬菌體的擴增過程變成10-100個拷貝，且這些拷貝基因能夠在噬菌體表面的p3蛋白上展示出抗體蛋白片段。

在噬菌體的擴增過程要使得文庫的多樣性得以保持和傳遞，需根據(jù)文庫的初始大小確定在擴增過程中含有噬菌粒的大腸桿菌的數(shù)目和體積，對應(yīng)加入的輔助噬菌體的多少進行有效感染，以及擴增后加入多少含有噬菌粒的噬菌體進行淘選等需要一一計算評估的問題，不同文庫大小的噬菌體庫在擴增過程中需要的擴增體積是不一樣的。一份固化的實驗方案很有可能會導(dǎo)致文庫多樣性的丟失。
要弄清楚這些問題，首先要具備以下幾點基礎(chǔ)的前置知識：

（??以下內(nèi)容全部劃重點?。。。?/span>

1. TG1大腸桿菌在OD600的讀數(shù)：1OD代表的菌濃度為1e9個/ml。
2. 噬菌體/輔助噬菌體在TG1處于對數(shù)生長期時有比較好的感染效率，TG1處于對數(shù)生長期的OD600值在0.4-0.8。
3. TG1在對數(shù)生長期的生長速度是20分鐘一代，需要密切關(guān)注TG1的生長，及時取菌進行實驗。4. 輔助噬菌體和TG1的比值MOI在20：1時能夠保證所有TG1被感染上。
5. 含有噬菌粒的噬菌體能夠感染正常的TG1大腸桿菌，并將噬菌粒留在TG1中并隨著TG1的擴增進行擴增，在無輔助噬菌體的情況下無噬菌體的擴增。
6. 噬菌粒質(zhì)粒含有青霉素抗性，輔助噬菌體含有卡那霉素抗性。
7. 含有噬菌粒的噬菌體可以通過感染正常的TG1，梯度稀釋涂青霉素抗性的瓊脂板進行滴度測定。8. 3+3模式下含有噬菌粒的噬菌體展示出p3融合抗體片段蛋白的效率比較低，只有5%-10%,在進行淘選時，加入的噬菌體的滴度應(yīng)是文庫多樣性的100倍以上。
還有一個比較關(guān)鍵的問題是噬菌體作為一種病毒，很容易以氣溶膠的形式擴散到空氣中污染實驗室的環(huán)境，從而感染F因子陽性的大腸桿菌。 （心疼一下生物汪，冒著生命危險搬磚?。。?/s>
在噬菌體展示的相關(guān)實驗需要在相對封閉的實驗室進行以避免噬菌體對于大腸桿菌的污染，特別是在培養(yǎng)正常的TG1大腸桿菌時。噬菌體的滅活方式通常是紫外照射半小時以上。
（合格的生物汪，是個莫得感情的病毒殺手?。?/s>