通過量化數(shù)值去快速選擇合適的反相色譜柱

1

前言

目前市面上商品化的反相色譜柱各式各樣，時常讓實驗人員眼花繚亂，產(chǎn)生幸福的煩惱，很難快速選擇合適的色譜柱。通常我們會從鍵合相類型、鍵合相在硅膠表面的覆蓋率、是否封端、封端類型等方面去選擇反相色譜柱。本文從已表征色譜柱的參數(shù)，通過量化數(shù)值去快速選擇合適的反相色譜柱。

2

色譜柱表征體系

色譜柱表征體系通過量化分析色譜柱中影響溶質保留行為的特征，對色譜柱進行分類，從而指導實際工作中色譜柱的選擇。有效的色譜柱表征體系應具有以下特點：

（1）考慮了對色譜柱選擇性有貢獻的所有因素；（2）每一個柱參數(shù)表征一種專屬的溶質—色譜柱相互作用；（3）能夠得到da部分商業(yè)柱的色譜柱參數(shù)；（4）對于特定色譜柱，不同實驗室能夠得到 可重現(xiàn)的色譜柱參數(shù)；（5）在特定實驗條件下測定的色譜柱參數(shù)能應用到任何流動相或任何柱溫下的分離。

目前國際上比較成熟的色譜柱表征體系有4個，分別是由Snyder、Euerby、Hoogmartens和USP色譜柱工作小組領導完成。其中，由Snyder等基于反相色譜保留機制提出的疏水消除模型，理論基礎較堅實，對色譜柱選擇性的表征較全面，與其余3個體系的柱參數(shù)本質上并無區(qū)別，均取自代表性溶質的保留值，參數(shù)測定方法簡便，實現(xiàn)選擇相似或者不同色譜柱的目的。由于USP網(wǎng)站公開常用色譜柱的參數(shù)，USP方法表征的色譜參數(shù)更方便我們篩選色譜柱。

3

色譜柱表征參數(shù)

對于反相色譜柱選擇性主要為疏水作用、立體選擇性和氫鍵作用，還有一些二級作用，比如：離子交換、金屬螯合作用等。

3.1 USP數(shù)據(jù)庫

疏水作用（Hy）：通過同yi流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行乙基苯測試，考察乙基苯的保留因子，保留因子越da，色譜柱的疏水作用越強。

立體選擇性（TFA）：通過同yi流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行阿米替林測試，考察阿米替林的拖尾因子，由于阿米替林特殊的立體結構，拖尾因子越小，色譜柱的立體選擇性越強，同時硅醇基作用較弱。

金屬雜質含量（CTF）：色譜柱中會殘留少量的金屬離子，一般金屬離子會與喹啉結構發(fā)生螯合作用，導致峰拖尾，故喹啉拖尾因子越da，色譜柱金屬雜質含量越da。

氫鍵作用（CFA）：阿米替林是堿性化合物，在酸性或中性條件下呈離子態(tài)，保留因子較小，保留主要依靠氫鍵作用，阿米替林保留因子越da，色譜柱氫鍵作用越強。

3.2 PQRI數(shù)據(jù)庫

疏水作用（H）：通過同yi流流動相體系，在不同的反相色譜柱對進行戊基苯和丁基苯測試，考察乙戊基苯和丁基苯的保留因子之比，比值越da，色譜柱對不同碳鏈長度化合物的選擇性越強，疏水作用越強。

立體選擇（S）：區(qū)分平面結構（三苯乙烯）和空間體積較da 的結構（鄰三苯基）的能力。前者與后者保留因子之比體現(xiàn)空間選擇性，比值越da，立體選擇越強。圖示見圖1。

氫鍵作用（A或B）：通過同yi流動相體系，在不同的反相色譜柱測試咖fei因和苯酚保留因子比值，數(shù)值越da，氫鍵作用越強。PQRI數(shù)據(jù)庫進一步將氫鍵能力描述為氫鍵酸度(A)、非電離硅烷與堿相互作用的能力和氫鍵堿度(B)、硅膠表面或鍵合相與酸性分析物的特性進一步相互作用的能力。

離子交換作用（pH2.7或7.0）：在流動相pH2.7和7.0下，分別測試苯芐胺和苯酚保留因子之比，比值越da，說明色譜柱區(qū)分極性化合物的能力越強。

固定相類型：A——A型硅膠，無定型硅膠，表面殘余da 量硅醇基；B——B型硅膠，球形高純硅膠，目前主流硅膠類型，硅醇基殘留少；E——鍵合相含嵌入極性基團的固定相；phenyl——聚苯乙烯聚合物固定相；F——氟代固定相。

對比USP與PQRI的數(shù)據(jù)信息，PQRI數(shù)據(jù)庫的色譜柱參數(shù)更加全面反應色譜柱的性能。

4

案例

目前色譜柱公司均推出各自方法開發(fā)的推薦色譜柱包，比如Waters公司推出經(jīng)濟實惠型的色譜柱包：XBridge C18，XBridge Shield RP18、CORTECS C18+、Xbridge Phenyl和Xselect HSS PFP。通過PQRI數(shù)據(jù)庫檢索。

從上表可知：

①疏水作用CORTECS C18+＞XBridge C18＞XBridge Shield RP18/Xselect HSS PFP＞XBridge Phenyl，XBridge Shield RP18的鍵合相含內嵌極性基團，碳載量相對低，苯基柱和五氟苯基柱比C18柱碳載量低，故H值較低。

②空間選擇性，Xselect HSS PFP較為突出，CORTECS C18+最低，S值反應硅膠表面鍵合相的密度。Xselect HSS PFP柱的空間選擇性強。

③氫鍵作用，XBridge Shield RP18和苯基柱最突出，XBridge C18最低，XBridge Shield RP18內嵌的酰胺基團和苯基與酸性和堿性分析物均有強偶極作用。這兩根柱子可以分離強極性化合物。

④離子交換作用，在酸性和中性條件下五氟苯基柱的離子交換能力突出，對苯環(huán)不同取代物的相似物質選擇性強，CORTECS C18+柱在中性條件下離子交換作用強，其對酸性化合物增強保留，對堿性化合物有較好的峰型。

這四款反相色譜柱，各具特點，在分離不同特點的化合物時具有各自的特長，在方法開發(fā)中他們可以互補，可提高柱篩選的效率。

在實際工作中，有好多方法有指定的色譜柱，但我們在研究過程中，會找性能相似的色譜柱作為備選色譜柱?？梢酝ㄟ^PQRI數(shù)據(jù)庫查找與目標色譜柱相似的色譜柱，只要F值在3以內，均可嘗試。比如方法中規(guī)定選用Nucleodur C18 Gravity，一個小眾品牌的色譜柱，如果想替代之，可從數(shù)據(jù)查詢與之類似的色譜柱。

從上可知：與Nucleodur C18 Gravity相似的色譜柱很多，有我們熟悉的Waters Cortecs C18、島津Inertsil ODS-2和Kromasil C18，并且完全替代Nucleodur C18 Gravity使用的概率很高。

5

小結

反相色譜柱表征體系逐漸成熟，并且廣泛地用于篩選色譜柱。根據(jù)da 多待測物質性質結合色譜柱參數(shù)可快速篩選目標色譜柱。但色譜柱表征體系針對特定樣品中難分離物質對的分離，還有待細化。對于結構類似待測物的分離只和部分關鍵色譜柱參數(shù)有關。因此，如何更好地研究難分離物質與關鍵色譜柱參數(shù)的關系，并針對品種在液相色譜方法中規(guī)定關鍵柱參數(shù)的zui佳范圍，還需要研究者的不斷探索。