瑞士oligo DNA核酸快速脫保護(hù)基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護(hù)基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀是為有效制備生物樣品而設(shè)計(jì)的，用于PCR引物、探針和組分生產(chǎn)，DNA測(cè)序、DNA和RNA合成、隨機(jī)啟動(dòng)、載體設(shè)計(jì)、DNA指紋和人工基因合成。是DNA/RNA/寡核苷酸脫保護(hù)基快捷高效穩(wěn)定的解決方案。反應(yīng)可直接在96位樣品架上進(jìn)行，如“深井”板。6-10個(gè)樣品架可用于10升壓力反應(yīng)器。因此，操作工作量大大縮短。樣品被填充不同的板，例如帶有過(guò)濾底座、特殊蓋等，通過(guò)設(shè)計(jì)的電動(dòng)升降系統(tǒng)，在反應(yīng)中和反應(yīng)后自動(dòng)移出壓力容器進(jìn)行干燥。在開(kāi)啟和關(guān)閉過(guò)程中，會(huì)抽走腐蝕性反應(yīng)氣體，確保實(shí)驗(yàn)室人員的完全安全。與樣品的反應(yīng)發(fā)生在氣相的壓力和微波效應(yīng)下。高氣相濃度會(huì)在幾分鐘內(nèi)引起完全均勻的反應(yīng)。在系統(tǒng)中，所有操作參數(shù)均一直根據(jù)程序條件進(jìn)行控制，并以圖形方式記錄和存儲(chǔ)以進(jìn)行質(zhì)量控制。在整個(gè)過(guò)程中，液體試劑以及氣相中的壓力和溫度是被控制的。這確保了樣品的完整、可重復(fù)和均勻反應(yīng)，以便隨后分離出選擇性DNA序列。獨(dú)特的10升反應(yīng)器容量為極高的樣品吞吐量提供了新的可能性。

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護(hù)基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀應(yīng)用：

食品工業(yè)

研究機(jī)構(gòu)

大學(xué)

分子生物學(xué)

遺傳學(xué)

合成生物學(xué)

醫(yī)學(xué)

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護(hù)基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀特點(diǎn)：

反應(yīng)器容量：10升容量

樣品數(shù)量：6至10個(gè)，每個(gè)樣品有96位。

溫度范圍:*200°C

功率輸出：1200瓦

符合CE標(biāo)志

保修12個(gè)月

電源：220 V至240 V/50/60 Hz

*功耗：2500瓦

顯示屏：彩色觸摸屏

尺寸:W x D x H 52 x 73 x 123厘米（無(wú)終端）

重量：180公斤

DNA化學(xué)合成固有的錯(cuò)誤率較高，片段越長(zhǎng)越是如此，挑選序列正確的克隆所花費(fèi)的時(shí)間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實(shí)花費(fèi)了無(wú)數(shù)學(xué)生們的不少好時(shí)光。所以，大家的選擇標(biāo)準(zhǔn)也從價(jià)格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過(guò)去拼價(jià)格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。

說(shuō)起DNA合成，幾位前輩師兄師姐們猶會(huì)提起上世紀(jì)90年代世行dai款買儀器，好些單位甚至醫(yī)院都趕時(shí)髦買了DNA合成儀，買回來(lái)才發(fā)現(xiàn)自己那點(diǎn)合成需求和費(fèi)用，委實(shí)買得起用不起，那昂貴的設(shè)備成了擺設(shè)。彼時(shí)國(guó)外DNA合成雖然質(zhì)量好純度高，可寄回來(lái)海關(guān)不好過(guò)，時(shí)間上實(shí)在傷不起，幸虧國(guó)內(nèi)迅速崛起的幾家DNA定制合成供應(yīng)商，以到貨速度快和價(jià)格優(yōu)勢(shì)漸漸占據(jù)了低端市場(chǎng)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，DNA定制合成于是變成了發(fā)傳真+等收貨那么簡(jiǎn)單的事。

也沒(méi)那么簡(jiǎn)單。DNA化學(xué)合成固有的錯(cuò)誤率較高，片段越長(zhǎng)越是如此，挑選序列正確的克隆所花費(fèi)的時(shí)間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實(shí)花費(fèi)了無(wú)數(shù)學(xué)生們的不少好時(shí)光。所以，大家的選擇標(biāo)準(zhǔn)也從價(jià)格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過(guò)去拼價(jià)格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。不純化，PAGE純化，HPLC純化，到反相純化，有多大區(qū)別？純化過(guò)的DNA oligo是不就去除了全部錯(cuò)誤序列呢？我們得先從DNA合成的錯(cuò)誤成因談起：

1. 內(nèi)部缺失（n-1，n-2 etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA zui普遍與zui主要的限制因素，且不能通過(guò)純化DNA oligo來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題?；瘜W(xué)合成DNA不及活細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細(xì)胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯(cuò)誤率在1/1000——1/10000，并且還可通過(guò)DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化學(xué)合成DNA不同，每單個(gè)合成循環(huán)的錯(cuò)誤率約為1/100，隨堿基數(shù)目增加而增加。其原因包括：

(1)DNA oligo的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過(guò)化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說(shuō)，在每次進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，都會(huì)有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對(duì)這種截?cái)嗟氖⌒蛄?，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進(jìn)行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達(dá)到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截?cái)嘈蛄袣埩粼诤铣傻腄NA粗制品中。

(2)DNA oligo的不完全脫保護(hù)。寡核苷酸的完全脫保護(hù)包括從磷酸酯基團(tuán)、堿基上的環(huán)外氨基和5′-OH部分上去掉保護(hù)基團(tuán)。脫保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達(dá)到100%，未脫保護(hù)的堿基無(wú)法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致DNA oligo內(nèi)部缺失堿基。

(3)不斷延長(zhǎng)的DNA鏈與不斷累積的副產(chǎn)物會(huì)干擾DNA oligo的化學(xué)合成。

對(duì)于以上三方面問(wèn)題，至今為止還沒(méi)有找到一個(gè)完美的解決方案。因?yàn)檠娱L(zhǎng)蓋帽時(shí)間也不能保證封閉反應(yīng)效率達(dá)到100%；而對(duì)于脫保護(hù)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，增加脫保護(hù)試劑量及延長(zhǎng)脫保護(hù)時(shí)間又會(huì)導(dǎo)致DNA oligo脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不完全脫保護(hù)與脫嘌呤同時(shí)控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截?cái)嘈蛄薪^不可能100%去除干凈，對(duì)于幾種純化方法來(lái)說(shuō)，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截?cái)嘈蛄?，zui好的方法是通過(guò)PAGE純化降低截?cái)嘈蛄袛?shù)量。

2.　單核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo產(chǎn)物中的另一種常見(jiàn)的序列錯(cuò)誤。

當(dāng)同一DNA oligo分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入(n+1)同時(shí)又存在單堿基缺失（n-1）時(shí)，此條DNA oligo的長(zhǎng)度與目的DNA分子的長(zhǎng)度相同，因此無(wú)法通過(guò)OPC 、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。 DNA oligo化學(xué)合成存在的這些弊端曾被Hecker KH與Rill R報(bào)道過(guò)（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides.　Biotechniques，1998 Feb；24：256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長(zhǎng)鏈DNA oligo，用它們進(jìn)行PCR克隆，然后測(cè)序鑒定了10個(gè)克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個(gè)單堿基缺失，一個(gè)連續(xù)的4個(gè)堿基缺失，一個(gè)G-C替換。除了這些堿基錯(cuò)誤，其它學(xué)者還曾報(bào)道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。

為了解決上述堿基出錯(cuò)的問(wèn)題，首先要優(yōu)化化學(xué)合成方法來(lái)提高DNA oligo的純度，并且對(duì)DNA oligo粗制品進(jìn)行純化，雖然無(wú)論哪種純化方式都不能保證百分之百去除錯(cuò)誤序列，但能改善產(chǎn)品的純度，進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)的成功率。Oligo的純化方式最常見(jiàn)的有脫鹽、OPC、PAGE和HPLC。脫鹽只能去除氨、鹽等雜質(zhì)，而不能有效去除合成過(guò)程中產(chǎn)生的短片段，因此一般只能用于普通的PCR反應(yīng)和測(cè)序。HPLC和PAGE純化得到的純度很高，但只能進(jìn)行手工操作，相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。OPC不僅能去除短片段，當(dāng)DNA oligo的長(zhǎng)度在40 bases以內(nèi)，其純度與HPLC或PAGE純化的純度相當(dāng)，而且由于簡(jiǎn)便、快捷，能進(jìn)行高通量（high-throughput）和自動(dòng)化（automation）操作，因而受到很多DNA合成公司的青睞。

但OPC純化也有一個(gè)缺點(diǎn)，就是在操作過(guò)程中需要一種弱酸脫掉DMT基團(tuán)，而DNA Oligo在酸性條件下容易脫嘌呤（depurination）。對(duì)于脫嘌呤后的堿基，DNA聚合酶不能識(shí)別，可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)堿基缺失或錯(cuò)配。因此，有些公司不推薦OPC純化用于克隆、突變、基因合成等實(shí)驗(yàn)。

一般來(lái)說(shuō)，不同廠家的合成方法其實(shí)并沒(méi)有什么大的本質(zhì)的區(qū)別，只是有一些經(jīng)驗(yàn)的積累和技巧。比如脫保護(hù)劑濃度的選擇很重要，太低脫保護(hù)不完全，太高又增加脫嘌呤的機(jī)率，還有如何優(yōu)化程序，使蓋帽更充分、更完全等等…。純化方式的選擇，一般說(shuō)來(lái)修飾標(biāo)記要用HPLC純化，長(zhǎng)鏈要用PAGE 純化，但這兩種純化方式都非常費(fèi)時(shí)耗力。

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護(hù)基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀是為有效制備生物樣品而設(shè)計(jì)的，用于PCR引物、探針和組分生產(chǎn)，DNA測(cè)序、DNA和RNA合成、隨機(jī)啟動(dòng)、載體設(shè)計(jì)、DNA指紋和人工基因合成。是DNA/RNA/寡核苷酸脫保護(hù)基快捷高效穩(wěn)定的解決方案。反應(yīng)可直接在96位樣品架上進(jìn)行，如“深井”板。6-10個(gè)樣品架可用于10升壓力反應(yīng)器。因此，操作工作量大大縮短。樣品被填充不同的板，例如帶有過(guò)濾底座、特殊蓋等，通過(guò)設(shè)計(jì)的電動(dòng)升降系統(tǒng)，在反應(yīng)中和反應(yīng)后自動(dòng)移出壓力容器進(jìn)行干燥。在開(kāi)啟和關(guān)閉過(guò)程中，會(huì)抽走腐蝕性反應(yīng)氣體，確保實(shí)驗(yàn)室人員的完全安全。與樣品的反應(yīng)發(fā)生在氣相的壓力和微波效應(yīng)下。高氣相濃度會(huì)在幾分鐘內(nèi)引起完全均勻的反應(yīng)。在系統(tǒng)中，所有操作參數(shù)均一直根據(jù)程序條件進(jìn)行控制，并以圖形方式記錄和存儲(chǔ)以進(jìn)行質(zhì)量控制。在整個(gè)過(guò)程中，液體試劑以及氣相中的壓力和溫度是被控制的。這確保了樣品的完整、可重復(fù)和均勻反應(yīng)，以便隨后分離出選擇性DNA序列。獨(dú)特的10升反應(yīng)器容量為極高的樣品吞吐量提供了新的可能性。

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護(hù)基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀應(yīng)用：

食品工業(yè)

研究機(jī)構(gòu)

大學(xué)

分子生物學(xué)

遺傳學(xué)

合成生物學(xué)

醫(yī)學(xué)

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護(hù)基反應(yīng)器——DNA專用氨解儀特點(diǎn)：

反應(yīng)器容量：10升容量

樣品數(shù)量：6至10個(gè)，每個(gè)樣品有96位。

溫度范圍:*200°C

功率輸出：1200瓦

符合CE標(biāo)志

保修12個(gè)月

電源：220 V至240 V/50/60 Hz

*功耗：2500瓦

顯示屏：彩色觸摸屏

尺寸:W x D x H 52 x 73 x 123厘米（無(wú)終端）

重量：180公斤

DNA化學(xué)合成固有的錯(cuò)誤率較高，片段越長(zhǎng)越是如此，挑選序列正確的克隆所花費(fèi)的時(shí)間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實(shí)花費(fèi)了無(wú)數(shù)學(xué)生們的不少好時(shí)光。所以，大家的選擇標(biāo)準(zhǔn)也從價(jià)格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過(guò)去拼價(jià)格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。

說(shuō)起DNA合成，幾位前輩師兄師姐們猶會(huì)提起上世紀(jì)90年代世行dai款買儀器，好些單位甚至醫(yī)院都趕時(shí)髦買了DNA合成儀，買回來(lái)才發(fā)現(xiàn)自己那點(diǎn)合成需求和費(fèi)用，委實(shí)買得起用不起，那昂貴的設(shè)備成了擺設(shè)。彼時(shí)國(guó)外DNA合成雖然質(zhì)量好純度高，可寄回來(lái)海關(guān)不好過(guò)，時(shí)間上實(shí)在傷不起，幸虧國(guó)內(nèi)迅速崛起的幾家DNA定制合成供應(yīng)商，以到貨速度快和價(jià)格優(yōu)勢(shì)漸漸占據(jù)了低端市場(chǎng)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，DNA定制合成于是變成了發(fā)傳真+等收貨那么簡(jiǎn)單的事。

也沒(méi)那么簡(jiǎn)單。DNA化學(xué)合成固有的錯(cuò)誤率較高，片段越長(zhǎng)越是如此，挑選序列正確的克隆所花費(fèi)的時(shí)間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實(shí)花費(fèi)了無(wú)數(shù)學(xué)生們的不少好時(shí)光。所以，大家的選擇標(biāo)準(zhǔn)也從價(jià)格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過(guò)去拼價(jià)格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。不純化，PAGE純化，HPLC純化，到反相純化，有多大區(qū)別？純化過(guò)的DNA oligo是不就去除了全部錯(cuò)誤序列呢？我們得先從DNA合成的錯(cuò)誤成因談起：

1. 內(nèi)部缺失（n-1，n-2 etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA zui普遍與zui主要的限制因素，且不能通過(guò)純化DNA oligo來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題?；瘜W(xué)合成DNA不及活細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細(xì)胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯(cuò)誤率在1/1000——1/10000，并且還可通過(guò)DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化學(xué)合成DNA不同，每單個(gè)合成循環(huán)的錯(cuò)誤率約為1/100，隨堿基數(shù)目增加而增加。其原因包括：

(1)DNA oligo的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過(guò)化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說(shuō)，在每次進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，都會(huì)有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對(duì)這種截?cái)嗟氖⌒蛄校瑸榱朔乐蛊鋮⑴c后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進(jìn)行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達(dá)到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截?cái)嘈蛄袣埩粼诤铣傻腄NA粗制品中。

(2)DNA oligo的不完全脫保護(hù)。寡核苷酸的完全脫保護(hù)包括從磷酸酯基團(tuán)、堿基上的環(huán)外氨基和5′-OH部分上去掉保護(hù)基團(tuán)。脫保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達(dá)到100%，未脫保護(hù)的堿基無(wú)法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致DNA oligo內(nèi)部缺失堿基。

(3)不斷延長(zhǎng)的DNA鏈與不斷累積的副產(chǎn)物會(huì)干擾DNA oligo的化學(xué)合成。

對(duì)于以上三方面問(wèn)題，至今為止還沒(méi)有找到一個(gè)完美的解決方案。因?yàn)檠娱L(zhǎng)蓋帽時(shí)間也不能保證封閉反應(yīng)效率達(dá)到100%；而對(duì)于脫保護(hù)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，增加脫保護(hù)試劑量及延長(zhǎng)脫保護(hù)時(shí)間又會(huì)導(dǎo)致DNA oligo脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不完全脫保護(hù)與脫嘌呤同時(shí)控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截?cái)嘈蛄薪^不可能100%去除干凈，對(duì)于幾種純化方法來(lái)說(shuō)，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截?cái)嘈蛄?，zui好的方法是通過(guò)PAGE純化降低截?cái)嘈蛄袛?shù)量。

2.　單核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo產(chǎn)物中的另一種常見(jiàn)的序列錯(cuò)誤。

當(dāng)同一DNA oligo分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入(n+1)同時(shí)又存在單堿基缺失（n-1）時(shí)，此條DNA oligo的長(zhǎng)度與目的DNA分子的長(zhǎng)度相同，因此無(wú)法通過(guò)OPC 、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。 DNA oligo化學(xué)合成存在的這些弊端曾被Hecker KH與Rill R報(bào)道過(guò)（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides.　Biotechniques，1998 Feb；24：256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長(zhǎng)鏈DNA oligo，用它們進(jìn)行PCR克隆，然后測(cè)序鑒定了10個(gè)克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個(gè)單堿基缺失，一個(gè)連續(xù)的4個(gè)堿基缺失，一個(gè)G-C替換。除了這些堿基錯(cuò)誤，其它學(xué)者還曾報(bào)道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。

為了解決上述堿基出錯(cuò)的問(wèn)題，首先要優(yōu)化化學(xué)合成方法來(lái)提高DNA oligo的純度，并且對(duì)DNA oligo粗制品進(jìn)行純化，雖然無(wú)論哪種純化方式都不能保證百分之百去除錯(cuò)誤序列，但能改善產(chǎn)品的純度，進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)的成功率。Oligo的純化方式最常見(jiàn)的有脫鹽、OPC、PAGE和HPLC。脫鹽只能去除氨、鹽等雜質(zhì)，而不能有效去除合成過(guò)程中產(chǎn)生的短片段，因此一般只能用于普通的PCR反應(yīng)和測(cè)序。HPLC和PAGE純化得到的純度很高，但只能進(jìn)行手工操作，相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。OPC不僅能去除短片段，當(dāng)DNA oligo的長(zhǎng)度在40 bases以內(nèi)，其純度與HPLC或PAGE純化的純度相當(dāng)，而且由于簡(jiǎn)便、快捷，能進(jìn)行高通量（high-throughput）和自動(dòng)化（automation）操作，因而受到很多DNA合成公司的青睞。

但OPC純化也有一個(gè)缺點(diǎn)，就是在操作過(guò)程中需要一種弱酸脫掉DMT基團(tuán)，而DNA Oligo在酸性條件下容易脫嘌呤（depurination）。對(duì)于脫嘌呤后的堿基，DNA聚合酶不能識(shí)別，可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)堿基缺失或錯(cuò)配。因此，有些公司不推薦OPC純化用于克隆、突變、基因合成等實(shí)驗(yàn)。

一般來(lái)說(shuō)，不同廠家的合成方法其實(shí)并沒(méi)有什么大的本質(zhì)的區(qū)別，只是有一些經(jīng)驗(yàn)的積累和技巧。比如脫保護(hù)劑濃度的選擇很重要，太低脫保護(hù)不完全，太高又增加脫嘌呤的機(jī)率，還有如何優(yōu)化程序，使蓋帽更充分、更完全等等…。純化方式的選擇，一般說(shuō)來(lái)修飾標(biāo)記要用HPLC純化，長(zhǎng)鏈要用PAGE 純化，但這兩種純化方式都非常費(fèi)時(shí)耗力。