緩沖鹽使用不當(dāng)對(duì)色譜柱的影響及解決辦法

在色譜分析過程中常常需要使用緩沖鹽來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH 值，緩沖鹽的不當(dāng)使用對(duì)色譜柱可能造成柱壓升高、柱效下降以及使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化等影響：

1)柱壓升高; 原因：緩沖鹽使用不當(dāng)導(dǎo)致緩沖鹽析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙，阻礙流動(dòng)相傳質(zhì)，引起柱壓升高;

2)相同化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化; 原因：如果沒有沖洗干凈就進(jìn)行進(jìn)樣，色譜柱內(nèi)含有的鹽會(huì)使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化;

3)柱效下降; 原因：i)有些緩沖鹽會(huì)滲入到鍵合相的深處，損害硅膠基體，導(dǎo)致色譜柱鍵合相流失，柱床變松，柱效下降;ii)凝結(jié)在鍵合相表面，使C18碳鏈難以舒展，對(duì)物質(zhì)的保留能力下降，導(dǎo)致柱效下降。因此用過緩沖鹽后需要對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗，水中緩沖鹽濃度較大時(shí)應(yīng)特別引起注意。

流動(dòng)相中緩沖鹽的正確使用方法

1. 使用前的處理: 在使用緩沖鹽作流動(dòng)相之前需要用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱，直至基線平穩(wěn)。 原則上，用于沖洗的流動(dòng)相與分析時(shí)所用的流動(dòng)相含水的比例相同(或含水更多)，不同的只是用于沖洗用的流動(dòng)相中不含緩沖鹽。 理由：緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。用含緩沖鹽的(特別是做流動(dòng)相的水為飽和的緩沖鹽溶液時(shí))流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí)，如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動(dòng)相中含水的比例相對(duì)較小，不先沖洗掉，接下來做樣品的時(shí)候所用的流動(dòng)相中如果有機(jī)溶劑含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時(shí)，緩沖鹽將會(huì)在色譜柱柱體上析出，沉積下來，這將可能導(dǎo)致上述對(duì)色譜柱的損害。

2. 使用后的處理：用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相的區(qū)別是，用于沖洗的流動(dòng) 相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min，直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)不使用，要長(zhǎng)期保存，則需再加上一步，即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍，直至基線平穩(wěn)。

用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相的區(qū)別是，用于沖洗的流動(dòng)相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min，直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)不使用，要長(zhǎng)期保存，則需再加上一步，即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍，直至基線平穩(wěn). 緩沖液可以提供離子平衡的反離子，并使流動(dòng)相保持一定的離子強(qiáng)度和ph值，減少拖尾。

使用緩沖液要注意幾點(diǎn)

1：避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對(duì)鋼質(zhì)有腐蝕作用。

2：緩沖液要現(xiàn)配現(xiàn)用，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔天或放置長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)有很多怪現(xiàn)象發(fā)生。

3：實(shí)驗(yàn)后不可用有機(jī)溶劑直接過度，有機(jī)溶劑會(huì)處使鹽類析出，造成液路或色譜柱堵塞，可用95：5的水甲醇沖洗。

4：使用緩沖液要及時(shí)掌握ph范圍，做到胸中有數(shù)。

5：清洗液路和柱子時(shí)，有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗。

6：長(zhǎng)時(shí)間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類析出，可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路(拆下柱子，走30ml,再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞。

7：選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩。

如果流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例很高是不能用來沖洗緩沖鹽的，是洗不出來的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗，是可以把緩沖鹽沖洗出來的，然后用純的有機(jī)溶劑來保護(hù)柱子。方法是使用與流動(dòng)相相同濃度不含鹽的流動(dòng)相進(jìn)行清洗。但就是速度慢一些。用水是為了快速替換，一般在15分鐘以內(nèi)，且用0.8的流速較好. 如果用純水沖，容易造成鍵合的碳鏈的流失，用5%~10%甲醇水溶液沖. 可以用純水代替流動(dòng)相中的緩沖液，有機(jī)相不變。這樣沖洗柱子比較穩(wěn)妥。

色譜柱異常及解決辦法

柱壓與硅膠基質(zhì)的形態(tài)(如無定形或球形硅膠)、顆粒大小、填料合成條件、裝柱條件、所用流動(dòng)相和分析時(shí)的溫度有關(guān)。不同廠家的色譜柱柱壓會(huì)有所差別，相同流動(dòng)相和溫度的條件下，不同廠家的新色譜柱有的柱壓可 能相差4、5個(gè)MPa，特別是低端和高端色譜柱之間，這一區(qū)別比較明顯。這是由色譜柱廠家所選用的硅膠基質(zhì)及其生產(chǎn)條件決定的，這種差異的存在是正常的。同時(shí)需要說明的一點(diǎn)是，柱壓與柱效有一定的關(guān)系，通常柱效高的色譜柱柱壓相對(duì)而言會(huì)高一點(diǎn)，但柱壓高的色譜柱并不一定就具有高柱效。

在色譜柱的使用過程中柱壓通常會(huì)出現(xiàn)兩種升高的形式：

第一種是，隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)色譜柱柱壓慢慢上升，這是正常的;

第二種是，使用過程中(流動(dòng)相和溫度沒有改變的條件下)色譜柱壓力突然升高很多。這種壓力突然升高的現(xiàn)象，通常是由工作人員操作不當(dāng)引起的，

原因：1)樣品太臟，使用前沒有過濾，導(dǎo)致柱篩板堵塞. 2)樣品含有的雜質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不是很好，與流動(dòng)相混合后析出，導(dǎo)致柱塞板堵塞。 3)使用緩沖鹽，處理錯(cuò)誤，緩沖鹽在色譜柱中析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙。

對(duì)于第二種，即柱壓突然升高的情況，通常有以下幾種解決辦法：

1)將色譜柱反接，用含水比例較大的流動(dòng)相進(jìn)行沖洗，沖洗時(shí)點(diǎn)。

2)色譜柱進(jìn)樣一端的篩板取下，分別放在水中和甲醇中超聲或更換新的柱篩板。如果柱效沒變，但柱壓仍然較高，則應(yīng)考慮進(jìn)樣端填料受污染的問題，因此除了取下進(jìn)樣端篩板超聲外，還需要挖掉進(jìn)樣端的部分填料，挖去填料之前先檢查一下填料的顏色，如果填料的顏色發(fā)生了變化，則應(yīng)該挖掉直到見到白色的填料為止。

挖掉后色譜柱將出現(xiàn)一個(gè)缺口，填補(bǔ)缺口的填料可以從另一支相同品牌、相同型號(hào)的報(bào)廢色譜柱的出口端獲得，填料用有機(jī)溶劑如甲醇等調(diào)成糊狀裝入缺口處，壓緊刮平，再裝上篩板. 高效液相色譜系統(tǒng)中氣泡對(duì)檢測(cè)的影響及其解決方法 在我們進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，有時(shí)會(huì)遇到這樣一個(gè)問題：系統(tǒng)的流路中存在氣泡.

由于氣泡的存在，會(huì)造成色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成分析靈敏度下降;氣泡變大進(jìn)入流路或色譜柱時(shí)會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或不穩(wěn)定，使基線起伏. 造成上述現(xiàn)象的主要原因有三條：一是流動(dòng)相溶液中往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡;二是系統(tǒng)開始工作時(shí)未能將流路中的空氣驅(qū)趕干凈;三是在注入樣品時(shí)不注意混入了空氣. 為了避免這類問題的出現(xiàn)，液相色譜實(shí)際分析過程中必須重視對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣處理。

色譜柱在使用前，先進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是zui 佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性.

1、樣品的前處理：

a、使用流動(dòng)相溶解樣品。

b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。 c、使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

2、流動(dòng)相的配制：

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。

b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。

c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。

f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3、流動(dòng)相流速的選擇：

因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求zui佳柱效，使用zui佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。 當(dāng)選用zui佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

a.由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。 b.對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用。用水zui好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。

c.含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。加入die dan化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)

d.流動(dòng)相要求使用0.45 µm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

e.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

只要是有機(jī)溶劑就行,不過黏度不要太大,因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能夠防止細(xì)菌生長(zhǎng),沖柱子的目的就是為了防止細(xì)菌生長(zhǎng)堵塞儀器系統(tǒng)和柱子. 一般甲醇和乙腈相互沖洗是沒有問題的，但乙腈要比甲醇價(jià)格貴的 新柱子:首先要看你買的柱子是否可以把你要的峰和其他的峰分開，也就是分離度要好.其次就是看是否有拖尾或者前延峰。新柱子出現(xiàn)這樣的情況也是很正常的，可以通過改變流動(dòng)相條件來調(diào)整，加一些縫形改善劑也會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較理想!

在使用過程中，填料下沉，在柱子進(jìn)口處出現(xiàn)一個(gè)小空間，使得分離效果不良。 補(bǔ)救方法:卸開柱頭螺絲，找一點(diǎn)同類填料，用甲醇濕潤(rùn)后，添在柱子上，反復(fù)幾次。然后裝上螺絲，用溶劑沖洗1-2小時(shí)，使之平衡。

小結(jié)

正確使用緩沖鹽很有必要，既可以防止緩沖鹽析出，也可以達(dá)到提高色譜柱使用壽命的目的。我們不妨用一句話來總結(jié)它的使用方法：用前要過濾，用后需沖洗。