基于氣相色譜–高分辨Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)的高效大規(guī)模農(nóng)殘

【概述】

全世界都在使用農(nóng)藥來(lái)提高作物產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用對(duì)保證足夠的全球食物供應(yīng)至關(guān)重要。然而，對(duì)于消費(fèi)者以及致力于食品安全保障的政府部門來(lái)說(shuō)，如此廣泛的農(nóng)藥使用及其在最終產(chǎn)品中殘留的可能性，都是心頭之患。

因此，法律法規(guī)保障消費(fèi)者不會(huì)接觸到受農(nóng)藥污染的食物。這些法律法規(guī)要求對(duì)食物中出現(xiàn)的農(nóng)藥進(jìn)行種類和數(shù)量的監(jiān)測(cè)，并針對(duì)具體商品種類給出每種農(nóng)藥允許的最大殘留值（MRL）。由于化合物和商品種類組合的數(shù)量巨大，給實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確可靠的常規(guī)監(jiān)測(cè)帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。

實(shí)驗(yàn)室一直在面對(duì)不斷增長(zhǎng)的分析壓力，必須以高速度和有競(jìng)爭(zhēng)力的成本在單次樣本分析中實(shí)現(xiàn)廣譜農(nóng)藥篩查。絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)借助氣相色譜或液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀器以及定靶分析的策略。這類方法的確能夠在較大范圍內(nèi)覆蓋需監(jiān)測(cè)的化合物種類并達(dá)到所需靈敏度和選擇性。然而，它們只局限于目標(biāo)列表中的化合物，這些化合物通常是根據(jù)殘留量規(guī)定和法律法規(guī)的要求來(lái)選擇的，主要是為了證明被檢測(cè)的食物樣本適合食用。這些定靶分析技術(shù)通常需要事先仔細(xì)地為每種化合物優(yōu)化采集參數(shù)以及采集時(shí)間窗口以確保有效檢測(cè)。為了擴(kuò)展分析的視野，近年來(lái)使用高分辨全掃質(zhì)譜法的化合物篩查方法開始受到青睞。

這些篩查方法使用非定靶的分析策略，先運(yùn)行一個(gè)普通的全掃采集，然后再根據(jù)所用的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定靶數(shù)據(jù)處理。雖然數(shù)據(jù)分析也是根據(jù)目標(biāo)化合物列表進(jìn)行的，不過(guò)即便并未在數(shù)據(jù)采集時(shí)專門篩查這些未知化合物，仍然可以在數(shù)據(jù)回溯分析中對(duì)未知化合物進(jìn)行分析。

為使這一方法適用于常規(guī)分析，數(shù)據(jù)篩查處理軟件必須足夠快足夠準(zhǔn)，以便達(dá)到歐盟指令描述的要求1，在可接受的低假陰性率水平下實(shí)現(xiàn)低濃度農(nóng)殘的檢出。雖然對(duì)假陽(yáng)性率沒(méi)有具體要求，不過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室還是需要保證這個(gè)數(shù)字盡可能的低，以盡量減少進(jìn)一步分析所需的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的絕大部分樣品都是符合法律法規(guī)要求的，因此能夠快速的區(qū)分開符合要求的樣品和可能受到污染的樣品對(duì)實(shí)現(xiàn)高效非常重要。在初步的篩查之后，可能的陽(yáng)性樣品會(huì)使用另一套確證方法（例如，GC-MS/MS）進(jìn)行再分析，以確認(rèn)是否是陽(yáng)性結(jié)果，并準(zhǔn)確測(cè)定農(nóng)殘的濃度。確證分析涉及在合適的基質(zhì)中制備標(biāo)準(zhǔn)曲線等步驟，并不包含在本文描述的篩查方法當(dāng)中。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

Q Exactive GC 系統(tǒng)在 EI 全掃模式下運(yùn)行，分辨率為 60,000（FWHM，m/z 200）。此外，還以 15K、30K 和 120 K 等不同分辨率進(jìn)行了其它實(shí)驗(yàn)。色譜數(shù)據(jù)采集確保不少于每峰 11 個(gè)點(diǎn)，以保證峰面積積分的準(zhǔn)確性。

【樣品提取】

樣品前處理

首先用乙酸緩沖液和基于QuEChERS方法的提取程序處理食物和飼料樣品。簡(jiǎn)短來(lái)說(shuō)，將10 mL酸化的（1%乙酸）乙腈加入5g（早餐麥片或飼料）或10 g（水果蔬菜等）均質(zhì)化的樣品中。加入混合鹽類，震蕩并離心。向最終提取液（0.5或1 g/mL樣品的乙腈溶液）中加入55種農(nóng)藥的混合物，濃度范圍為0.5–100 ng/g（ppb）。我們分析了多種難度較大的基質(zhì)樣品，包括小麥、韭蔥，以及馬飼料。

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

在本研究中，我們?cè)u(píng)估了Thermo Scienti?cTM Q Exactive TM GC 組合四極桿-Orbitrap 質(zhì)譜儀（MS）在準(zhǔn)確篩查適合 GC 分析的農(nóng)藥時(shí)的表現(xiàn)。Q Exactive GC Orbitrap MS 能夠提供的質(zhì)量分辨率高達(dá) 120，000（m/z 200，峰高一半處的全峰寬，F(xiàn)WHM），因而能夠?qū)崿F(xiàn)高準(zhǔn)確度的質(zhì)量測(cè)定，從而有效地在復(fù)雜基質(zhì)中將被分析物與共流出的等質(zhì)量數(shù)干擾物等雜質(zhì)分離開。高掃速和單次目標(biāo)分析物掃描內(nèi)的高動(dòng)態(tài)范圍（> 5000）也都有助于從復(fù)雜基質(zhì)中檢出痕量化合物。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

本研究的目標(biāo)是以最高置信度在不同樣品基質(zhì)中大范圍篩查多種農(nóng)藥。分析以篩查樣品中農(nóng)藥殘留是否超過(guò)MRL水平（通常為10 ppb）為目的。評(píng)估方式是通過(guò)對(duì)不同加標(biāo)濃度的強(qiáng)化小麥（forti?ed wheat）、馬飼料、以及韭蔥提取液進(jìn)行篩查，測(cè)定所述條件下所加標(biāo)樣的最低檢出濃度。我們選擇這些基質(zhì)樣品是由于它們?cè)谵r(nóng)殘分析中以復(fù)雜和具有挑戰(zhàn)性而著稱，圖1所示總離子流譜圖也證明了這點(diǎn)。

常規(guī)農(nóng)殘分析使用的樣品提取方法非常普通（例如QuEChERS），得到的提取液非常復(fù)雜多變。由于樣品前處理階段缺乏選擇性，必須在儀器分析過(guò)程中進(jìn)行彌補(bǔ)。提高選擇性的方式可以是使用高質(zhì)量分辨率和高質(zhì)量精度進(jìn)行分析。隨著樣品復(fù)雜度的增加，質(zhì)譜儀的分辨能力對(duì)于可靠的農(nóng)殘檢測(cè)十分關(guān)鍵。分辨能力的重要性在適合LC的農(nóng)殘分析中已有體現(xiàn)2。此外，高分辨全掃分析無(wú)需優(yōu)化數(shù)據(jù)采集參數(shù)即可擴(kuò)大分析的視野的特性也十分誘人。

樣品通量

樣品通量是農(nóng)殘分析當(dāng)中需要考慮的一個(gè)重要因素。因此，我們使用了一個(gè)快速色譜方法來(lái)測(cè)試系統(tǒng)在常規(guī)條件下的表現(xiàn)。該色譜方法可以在17 min之內(nèi)（兩次進(jìn)樣之間）完成一次完整的分析，從而能夠在24小時(shí)之內(nèi)完成84次分析。這雖然是一個(gè)快速的GC方法，質(zhì)譜儀的高掃速仍然確保了每個(gè)色譜峰取到了至少11個(gè)點(diǎn)。圖2所示為峰寬為1.8秒的二嗪農(nóng)色譜峰，可見共有11個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

圖2.添加了 10 ng/mL 二嗪農(nóng)（m/z 179.11789 ± 5 ppm 質(zhì)量窗口）的小麥樣品分析的提取離子流圖（XIC），全峰包含 11 次掃描（峰寬 1.8 sec）。數(shù)據(jù)采集在全掃模式下進(jìn)行，分辨能力為 60,000 FWHM（m/z 200）。如圖所示，每次掃描的質(zhì)量準(zhǔn)確度和質(zhì)量差異（ppm）均非常理想，全峰的平均質(zhì)量差異為 0.3 ppm。

在以60,000質(zhì)量分辨率進(jìn)行了全掃分析之后，使用TraceFinder軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。樣品篩查使用一個(gè)包含了183種農(nóng)藥的分子式、準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時(shí)間、同位素峰分布（通過(guò)診斷離子的分子式推算）、以及碎片離子等信息的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。雖然以上所有參數(shù)都可以用于鑒定，軟件使用的陽(yáng)性檢出關(guān)鍵依據(jù)為：主要鑒定離子的提取離子流譜圖中在預(yù)期出峰時(shí)間±20秒窗口內(nèi)必須有色譜峰，并且測(cè)得的離子準(zhǔn)確質(zhì)量必須在理論值±2ppm范圍內(nèi)。同位素峰分布以及碎片離子的保留時(shí)間和準(zhǔn)確質(zhì)量。引入這些參數(shù)能夠提高分析結(jié)果的可信度并降低假陽(yáng)性率。

篩查軟件

好的數(shù)據(jù)處理軟件是成功執(zhí)行常規(guī)篩查的一個(gè)關(guān)鍵。TraceFinder軟件能夠迅速篩查數(shù)據(jù)并檢測(cè)是否存在目標(biāo)農(nóng)藥。我們使用了一個(gè)目標(biāo)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)檢測(cè)和報(bào)告檢出的農(nóng)藥，并注明滿足了哪些檢出標(biāo)準(zhǔn)。圖3給出了一個(gè)TraceFinder瀏覽窗口樣例，圖中顯示的是在添加了10 ng/mL標(biāo)樣的小麥樣品中檢出的一些農(nóng)藥。農(nóng)藥p,p'-DDT的檢出和確認(rèn)是基于保留時(shí)間、準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)（0.21 ppm）、碎片離子、以及同位素分布信息的吻合，在圖中以紅色標(biāo)出。數(shù)據(jù)以交通信號(hào)燈的形式展示在用戶面前，便于快速審閱。更詳細(xì)的信息可以在總結(jié)欄和窗口欄目中查閱，如本樣例中的XIC以及p,p'-DDT的理論和實(shí)際同位素分布情況。即便是在復(fù)雜基質(zhì)中，本系統(tǒng)也能夠提供無(wú)與倫比的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)據(jù)，使得化合物檢出的可信度非常高。所有農(nóng)藥篩查都在< 2 ppm的質(zhì)量準(zhǔn)確度下進(jìn)行，而如圖3所示，實(shí)際的質(zhì)量差異通常只有亞ppm水平。對(duì)主要的診斷離子和碎片離子來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確質(zhì)量檢測(cè)都能達(dá)到這種水平，從而可以自動(dòng)篩出假陽(yáng)性結(jié)果或提示用戶快速評(píng)估。

圖3.添加了10 ng/mL標(biāo)樣的小麥樣品中檢出的農(nóng)藥（以p,p'-DDT為例）在TraceFinder篩查瀏覽器中顯示界面。農(nóng)藥檢出的確認(rèn)是基于準(zhǔn)確質(zhì)量確認(rèn)（±2 ppm質(zhì)量窗口）、保留時(shí)間（RT）、同位素峰分布（IP）、和碎片離子（FI）信息的吻合。紅色方框提示的是主要離子和確證離子檢測(cè)的亞ppm水平質(zhì)量準(zhǔn)確度。

低于MRL水平的篩查

在本研究中，當(dāng)加標(biāo)濃度為10 ng/mL時(shí)，所有55種農(nóng)藥都在小麥、馬飼料、和韭蔥樣品中成功檢出。不僅如此，絕大多數(shù)農(nóng)藥都可以在更低的濃度被檢出。如圖4和5所示，在小麥基質(zhì)中，53種農(nóng)藥均可在< 2.5 ng/mL濃度水平下檢出，而在加標(biāo)水平降低至0.5 ng/mL時(shí)，仍有47種農(nóng)藥可被檢出。這種在復(fù)雜基質(zhì)中也可以達(dá)到的無(wú)可比擬的靈敏度能夠有效支持在MRL規(guī)定的濃度水平甚至更低水平實(shí)現(xiàn)可信篩查，這也成為Q Exactive GC系統(tǒng)的一個(gè)獨(dú)特特性。

圖4.小麥中55種農(nóng)藥的最低檢出標(biāo)樣濃度圖。鑒定基于準(zhǔn)確質(zhì)量差異< 2 ppm和保留時(shí)間差異不超過(guò)20秒。紅圈為5 ng/mL濃度水平。

圖5.馬飼料中55種農(nóng)藥的最低檢出標(biāo)樣濃度圖。鑒定基于準(zhǔn)確質(zhì)量差異< 2 ppm和保留時(shí)間差異不超過(guò)20秒。圖中強(qiáng)調(diào)了5 ng/mL和10 ng/mL濃度水平。

借助分辨能力避免假陰性結(jié)果

只有當(dāng)分辨能力足以將目標(biāo)化合物與基質(zhì)干擾和其它目標(biāo)化合物區(qū)分開來(lái)時(shí)，使用較低的質(zhì)量準(zhǔn)確度容忍度才成為可能。當(dāng)兩個(gè)質(zhì)量輪廓圖重合時(shí)，測(cè)得的質(zhì)量輪廓實(shí)際是兩者之和，導(dǎo)致目標(biāo)化合物的質(zhì)量測(cè)定不準(zhǔn)確。圖6顯示的正是這一現(xiàn)象。該實(shí)驗(yàn)分別以15K、30K、60K和120K分辨率對(duì)韭蔥樣品進(jìn)行了分析。質(zhì)譜圖中可見一個(gè)氯苯胺靈的診斷離子，以及一個(gè)質(zhì)量相近的背景基質(zhì)離子對(duì)其造成干擾。在60K和120K分辨率下，分析可達(dá)到預(yù)期的質(zhì)量準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)基線分離。然而在15K和30K分辨率時(shí)，氯苯胺靈未能與干擾離子實(shí)現(xiàn)分離，降低了質(zhì)量準(zhǔn)確度。尤其是在15K分辨率下，質(zhì)量準(zhǔn)確度受到嚴(yán)重影響，質(zhì)量差異高達(dá)18.4 ppm。按照本研究使用的篩查標(biāo)準(zhǔn)，即便將質(zhì)量差異容忍度進(jìn)一步放寬到10 ppm，仍然會(huì)造成氯苯胺靈的假陰性結(jié)果。這些試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明高于60,000的質(zhì)量分辨能力是必須的，而這個(gè)最低分辨能力的具體值則取決于樣品的復(fù)雜度以及目標(biāo)化合物和干擾物的濃度。

圖6.分辨能力會(huì)影響基質(zhì)中被分析物的質(zhì)量準(zhǔn)確度。在15K、30K、60K和120K質(zhì)量分辨率下采集的韭蔥提取液中，10 ng/mL氯苯胺靈的一個(gè)離子的質(zhì)譜圖。15K和30K分辨率不足以分開氯苯胺靈離子與基質(zhì)干擾峰，導(dǎo)致質(zhì)量精確度變差。在15K分辨率時(shí)，按照本研究的篩查標(biāo)準(zhǔn)，該農(nóng)藥會(huì)不能檢出，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

圖7.在TraceFinder軟件中查看韭蔥中丁苯嗎啉的提取離子流譜圖和校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)樣品進(jìn)行了三次平行重復(fù)進(jìn)樣，線性良好。

農(nóng)藥定量分析表現(xiàn)

在常規(guī)分析中，接下來(lái)應(yīng)該對(duì)樣品中檢出的農(nóng)藥進(jìn)行定量分析。我們?cè)?.5–50 ng/mL濃度范圍內(nèi)，用基質(zhì)匹配過(guò)的樣品評(píng)估了農(nóng)藥檢測(cè)的線性，每個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)品重復(fù)分析三次。在所有情況下，決定系數(shù)（R2）均> 0.99，平均值為R2= 0.997，回歸殘差< 25%。

圖7以丁苯嗎啉為例給出了化合物定量校準(zhǔn)曲線。檢出化合物的完整定量流程不在本研究討論范圍內(nèi)，不過(guò)在Thermo Scienti?c應(yīng)用文獻(xiàn)104493中有詳細(xì)描述。

結(jié)論

本次評(píng)估的結(jié)果顯示， Thermo Scientific Q Exactive GC 組合四級(jí)桿-Orbitrap 質(zhì)譜儀佐以 TraceFinder 軟件，對(duì)于食品和飼料的常規(guī)農(nóng)殘篩查來(lái)說(shuō)是一套極其有效的工具。Orbitrap 質(zhì)譜儀的分辨能力、質(zhì)量準(zhǔn)確度和靈敏度都非常出色。

1. 使用高分辨全掃質(zhì)譜分析進(jìn)行篩查是擴(kuò)大分析范圍的有效方法，憑借該技術(shù)，無(wú)需提前進(jìn)行采集參數(shù)優(yōu)化即可在單次實(shí)驗(yàn)中分析更多的化合物。

2. 快速GC分析和采集速率提高了實(shí)驗(yàn)室的分析效率和樣品通量。超群的質(zhì)量精確度再加上極高的靈敏度，使得可靠的常規(guī)農(nóng)殘篩查成為可能。

3. 以 60,000 FWHM （m/z 200）的質(zhì)量分辨率進(jìn)行數(shù)據(jù)采集能夠消除同質(zhì)量化合物的干擾，提高在復(fù)雜基質(zhì)中篩查農(nóng)藥的結(jié)果可信度。對(duì)所有化合物都持續(xù)提供亞 ppm 水平的質(zhì)量精度，確?；衔镨b定結(jié)果可信。

【儀器/耗材清單】

全部分析均使用Thermo Scienti?cTM Q Exactive TM GC組合四極桿-Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行。進(jìn)樣使用的Scienti?cTM Q TriPlusTM RSH自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜分離使用Thermo Scienti?cTMTRACETM 1310 GC，色譜柱為Thermo Scienti?cTMTraceGOLDTMTG-5SilMS 15m×0.25 mm I.D.×0.25 µm薄膜毛細(xì)管柱（P/N：26096-1301）。

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