雙向電泳儀技術(shù)性能與發(fā)展

雙向電泳儀有兩向電泳組成，第一向根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同在pH梯度凝膠中進行等點聚焦，第二向根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小不同在垂直方向或水平方向進行SDS－PAGE電泳。雙向電泳儀可以將2000～3000種蛋白質(zhì)進行分離。

一、蛋白質(zhì)組學研究：

1、蛋白質(zhì)組：

蛋白質(zhì)組是指一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)。

2、蛋白質(zhì)組學：

蛋白質(zhì)組學是指研究蛋白質(zhì)組的技術(shù)和這些研究所得到的結(jié)果，包括蛋白質(zhì)鑒定、翻譯后修飾及蛋白質(zhì)功能與疾病的關(guān)系。

3、蛋白質(zhì)組學研究的意義：

蛋白質(zhì)組學是連接基因、蛋白質(zhì)和疾病的紐帶，對蛋白質(zhì)表達變化或差異分析將具有重要的生物學意義和醫(yī)學應用價值，為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

4、蛋白質(zhì)組學研究所面臨的困難：

（1）細胞種類的多樣性。

（2）細胞的生命周期。

（3）蛋白質(zhì)生成的時效性。

（4）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和變異。

（5）研究方法。

5、雙向電泳的重要性：

原位細胞提取與樣品處理－雙向電泳－質(zhì)譜的技術(shù)路線是一條典型的蛋白質(zhì)組學研究的技術(shù)路線。

雙向電泳是研究蛋白組學的關(guān)鍵技術(shù)，是深刻認識蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要工具。

二、雙向電泳工作原理：

雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D－PAGE）是結(jié)合等電聚焦電泳（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點進行分離）和SDS－PAGE電泳（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進行分離）而形成的二維電泳，是分離分析蛋白質(zhì)最有效的電泳手段。

通常第一向電泳是等電聚焦電泳，在細管中（Ф1～3mm）中加入含有載體兩性電解質(zhì)、8M的脲酶和非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦，變性的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點的不同進行分離。然后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。將處理過的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液，使其固定并與濃縮膠連接。在第二向電泳中，結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進入SDS－聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其分子量大小被分離。這樣各個蛋白質(zhì)根據(jù)等電點和分子量的不同而被分離。

三、雙向電泳主要步驟：

雙向電泳是一項技術(shù)性很強并且很辛苦的工作。

1、樣品準備。

2、第一向形成pH梯度進行等電聚焦電泳。

3、第二向進行SDS－PAGE電泳。

4、考馬氏亮蘭染色或銀染色。

5、肉眼觀察或自動掃描，進行電泳圖分析。

四、雙向電泳存在的問題：

1、重復性差：方法尚未標準化，導致不同實驗室之間的結(jié)果難以重復。

2、定量困難。

五、雙向電泳的進展：

1、雙向平板電泳的進展：

（1）染色試劑有考馬氏亮蘭、銀染、同位素和熒光等。

（2）由染色檢測到直接紫外檢測。

（3）肉眼觀察到自動掃描。

2、由雙向平板電泳到雙向毛細管電泳（雙向柱電泳）：

（1）第一向為毛細管等電聚焦電泳。

（2）第二向為毛細管區(qū)帶電泳。

3、由雙向平板電泳到雙向芯片電泳。

4、由雙向平板電泳到多維電泳。