多功能酶標儀中熒光檢測技術介紹

熒光分析技術是一種強大的分析手段，廣泛地應用在臨床檢驗、生物學研究、農(nóng)業(yè)科學、食品和環(huán)境科學中，是多功能酶標儀的重要應用。

　　1.概述

　　室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量(光能、化學能、電能或熱能)后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象”。分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學發(fā)光，生物發(fā)光等。受到光照時發(fā)光，光照切斷時發(fā)光立即消失的叫熒光，光照切斷時，發(fā)光逐漸變弱以致消失的叫磷光，吸收化學反應的化學能量而發(fā)光叫化學發(fā)光，由生物能轉變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。

　　由于發(fā)光物質不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線光譜，通常所說的熒光為分子熒光。通過測定所發(fā)射熒光的特性和強度，可以對物質進行定性、定量分析。

　　2.熒光檢測技術

　　2.1熒光強度(FI)

　　熒光強度與熒光物質的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學上的應用非常廣泛，可以進行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細胞學分析(細胞增殖，細胞毒理，細胞吸附等)和分子間相互作用。

　　2.1.1細胞凋亡檢測

　　Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小 亞基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

　　設計出熒光物質偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光(圖1)。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

　　圖1. Caspase-3水解Z-DEVD- AMC

　　2.1.2細胞毒性的檢測

　　體外細胞毒性研究對于檢測新的生物來源或人工合成的細胞毒素以及例行的臨床相關的檢測都有著重要的意義。細胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細胞膜，熒光密度越高反映出其受損細胞越多。

　　2.1.3鈣流檢測

　　Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細胞內鈣離子濃度的變化，當結合鈣離子時，最大激發(fā)波長會發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強度和結合的Ca2+濃度有著定量的關系。

　　2.2熒光偏振(FP)

　　1926年Perrin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時，可吸收并釋放出相應的偏振熒光，如果在激發(fā)時熒光物質處于靜止狀態(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動狀態(tài)，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現(xiàn)象，熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結合或排斥;其所處環(huán)境的性質，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響。因此以熒光偏振為基礎發(fā)展的技術可用來研究生命科學中分子之間的相互作用，如受體配體結合分析，DNA-蛋白質結合分析，SNP分析，酶活性分析。

　　熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達亞納摩爾級范圍，重復性好，操作簡便，也更為安全可靠，不會在實驗過程中生成有害的放射性廢物，此外熒光偏振是真正均相的，允許實時檢測(動力學檢測)，對于濃度變化不敏感，是均相檢測形式(中間不含洗滌步驟)的最佳解決方案。

　　2.3時間分辨熒光(TRF)

　　在做熒光測定的時候，由于背景熒光信號干擾，使用傳統(tǒng)的發(fā)色團進而進行熒光檢測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此使用長衰減壽命的標記物就可以使瞬時熒光干擾減到最小化。

　　時間分辨熒光是用稀土元素作為標記物，稀土三價離子的電子云的結構會一定程度上限制了電子的遷移，導致這類元素發(fā)生的熒光的衰減周期通常是很長的，從而消除背景熒光的干擾 大大提高檢測的靈敏度(表2)。應用稀土元素作標記物的另一個好處是激發(fā)光與發(fā)射光峰值Stoke 位移大。這就可消除激發(fā)光和散射光的干擾，同時, 被激發(fā)的熒光光帶極窄, 熒光的發(fā)射峰非常尖銳, 可使儀器調整在極窄的波長范圍內測定, 極大地降低了來自背景的各種干擾。

　　表2.常見熒光團隊熒光壽命

　　時間分辨熒光靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、標記物制備簡便、檢測重復性好、操作流程短，適用于生物學、醫(yī)學上的超微量分析，像激素檢測，病毒性肝炎標志物檢測，靶向細胞的標記檢測以及藥物篩選等方面。

　　2.4熒光共振能量傳遞(FRET)

　　熒光共振能量傳遞現(xiàn)象是Perrin在20世紀初首先發(fā)現(xiàn)的，1948年，F(xiàn)oster創(chuàng)立了理論原理，指熒光能量供體與受體間通過偶極-偶極耦合作用轉移能量的過程，這種能量的轉移是非放射性的，產(chǎn)生FRET的條件主要有三個：(1)供體與受體間足夠靠近(1～10 nm);(2)供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有一定的重疊;(3)給體與受體的偶極具一定的空間取向，這是偶極-偶極耦合作用的條件。

　　熒光共振能量傳遞因為要考慮到供體和受體之間的距離，所以經(jīng)常用來研究分子間的相互作用，像蛋白質的相互作用，抗原抗體結合，受體與配體的結合，另外在膜反應、離子通道等方面的研究也有相應應用。將FRET熒光探針標記的肽鏈，加入到固體表面的雙層膜中，通過熒光漂白恢復(FRAP)成像技術檢測，為研究跨膜螺旋二聚作用提供一個新的方法。用FRET標記細胞質，應用時間分辨技術，檢測其對P2X離子通道的門控作用。

　　利用Eu等長效熒光物質作為供體，來進行熒光共振能量傳遞，在激發(fā)光熄滅后受體仍能較長的能量衰減時間，能量傳遞效率更高，可檢測的相互作用距離更長，可達到100-200nm，時間延遲檢測，降低了背景噪音，提高了靈敏度