轉(zhuǎn)錄組常見問題與解答

轉(zhuǎn)錄組是某個(gè)物種或者特定細(xì)胞類型產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq) 是最近發(fā)展起來的利用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析的方法,可以對(duì)全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行系統(tǒng)的研究。 

Roche GS FLX Titanium 、IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4均可以對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序， Roche GS FLX Titanium與IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4相比，擁有更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)和較小的數(shù)據(jù)量，適用于表達(dá)量較高基因的RNA全長(zhǎng)測(cè)序。但是對(duì)低表達(dá)豐度的基因，可能需要多次測(cè)序才能得到足夠的數(shù)據(jù)，成本比較高 ，而IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4數(shù)據(jù)讀取量大，能夠得到較高的覆蓋率，可以較好的降低成本。若是位置基因組序列的物種，則Roche GS FLX Titanium測(cè)序更有優(yōu)勢(shì)，其較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)便于拼接，獲得更好的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)。 

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以供研究者在轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究（基因邊界鑒定、可變剪切研究等），轉(zhuǎn)錄本變異研究（如基因融合、編碼區(qū) SNP研究），非編碼區(qū)域功能研究（Non-coding RNA研究、miRNA前體研究等），基因表達(dá)水平研究以及全新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)等方面進(jìn)行深入研究。  

1研究轉(zhuǎn)錄組的方法有哪些？ 

答：目前研究轉(zhuǎn)錄組的方法主要三種，基于雜交技術(shù)的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，基于sanger測(cè)序法的SAGE (serial analysis of gene expression)、LongSAGE和MPSS(massively parallel signature sequencing)，基于第二代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，又稱為RNA-Seq。  

2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比其他研究方法有哪些優(yōu)勢(shì)?

答：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序具有以下優(yōu)勢(shì)：

（1）可以直接測(cè)定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本片段序列、單核苷酸分辨率的準(zhǔn)確度，同時(shí)不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號(hào)帶來的交叉反應(yīng)和背景噪音問題；（2）靈敏度高，可以檢測(cè)細(xì)胞中少至幾個(gè)拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本；（3）可以對(duì)任意物種進(jìn)行全基因組分析，無需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并準(zhǔn)確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)及cSNP，UTR區(qū)域。（4）檢測(cè)范圍廣，高于6個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，能夠同時(shí)鑒定和定量稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本。  

3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有什么樣的樣品要求？

答： （1） 樣品純度要求： OD值應(yīng)在1.8至2.2之間；電泳檢測(cè)28S:18S至少大于1.8。 （2）樣品濃度： total RNA濃度不低于400 ng/μg。 （3）total RNA樣品請(qǐng)置于-20℃保存；請(qǐng)?zhí)峁﹖otal RNA樣品具體濃度、體積、制備時(shí)間、溶劑名稱及物種來源。請(qǐng)同時(shí)附上QC數(shù)據(jù)，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測(cè)數(shù)據(jù)。 （4）樣品請(qǐng)置于1.5 ml管中，管上注明樣品名稱、濃度以及制備時(shí)間，管口使用Parafilm封口。建議使用干冰運(yùn)輸，并且盡量選用較快的郵遞方式，以降低運(yùn)輸過程中樣品降解的可能性。  

4mRNA的純化分離方法？ 

答：進(jìn)行mRNA研究中，首先需要對(duì)樣本進(jìn)行總RNA抽提，抽提得到的RNA除含有mRNA外，還含有rRNA和tRNA，為防止這兩類RNA對(duì)轉(zhuǎn)錄組研究的影響，因此我們需要對(duì)mRNA進(jìn)行分離純化。真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞mRNA的3’端存在20-30個(gè)腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。 mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。  

5、使用Solexa進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)，樣本RNA如何進(jìn)行片段化處理？ cDNA插入片段長(zhǎng)度的選擇？ 

答：Solexa轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建時(shí)采用專用的打斷Buffer對(duì)RNA樣本進(jìn)行片段化處理，這種方法充分利用RNA對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子的敏感性，具有穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，通過這種方法打斷能得到更加均勻的覆蓋率。mRNA-seq可以既可以采用單端測(cè)序（single read） 還可以采用雙端測(cè)序（ paired end），對(duì)于單端測(cè)序來說片段長(zhǎng)度150-200bp是理想的長(zhǎng)度范圍，對(duì)于雙端測(cè)序來說片段長(zhǎng)度推薦300-500bp，由于兩端加入了Solexa的錨定序列和引物序列，樣品準(zhǔn)備完成后所獲得的產(chǎn)物長(zhǎng)度比插入的cDNA長(zhǎng)度要長(zhǎng)。  

6、文庫(kù)準(zhǔn)備過程中，反轉(zhuǎn)錄引物的選擇？ 

答：在進(jìn)行cDNA合成過程中，經(jīng)常用到的有兩種引物：oligodT引物和隨機(jī)引物。 
在RNA反轉(zhuǎn)錄過程中使用oligodT引物進(jìn)行擴(kuò)增可以保證擴(kuò)增產(chǎn)物包括mRNA的3'末端，減少rRNA的干擾，但是采用oligodT 引物擴(kuò)增有一個(gè)問題，就是擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度偏短和擴(kuò)增產(chǎn)物所包含的信息量偏向3’端的問題，之所以有長(zhǎng)度偏短，一方面與RNA完整性有關(guān)，但最重要的限制在于逆轉(zhuǎn)錄酶的延伸能力。 用oligodT 引物擴(kuò)增出來的片段長(zhǎng)度短，雖然都有mRNA的3'端，但是序列信息多位于3'-UTR附近，若擴(kuò)增序列太短，則有用信息很少，不利于序列的識(shí)別和分析。 
使用Random primer擴(kuò)增，雖然擴(kuò)增偏短長(zhǎng)度也很短， 但是由于它的逆轉(zhuǎn)錄并不一定在mRNA的末端起始，而是在隨機(jī)位置起始，所以它的擴(kuò)增片段帶有更多CDS的信息，但是如果是用總RNA逆轉(zhuǎn)錄的話，有可能會(huì)受到rRNA的干擾。 
采用Solexa進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序文庫(kù)準(zhǔn)備過程中，由于實(shí)驗(yàn)之前已經(jīng)采用oligodT微磁珠進(jìn)行純化，而且mRNA已經(jīng)進(jìn)行了片段化處理后才進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，因此反轉(zhuǎn)錄只能采用隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA的合成，如果采用oligodT進(jìn)行擴(kuò)增，只能得到mRNA的3'端序列，無法得到完整的mRNA序列。 
 

7、 Solexa進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序文庫(kù)的制備方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)？ 

答：首先會(huì)樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，檢測(cè)合格后，對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序前處理，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，構(gòu)建步驟為：（1）首先利用oligodT微珠純化mRNA；（2）將純化得到的mRNA進(jìn)行片段化處理；（3）利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；（4）以cDNA第一鏈為模板合成雙鏈cDNA；（5）對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)并在3’末端加’A”；（6）在DNA片段的兩端連接上特定的測(cè)序接頭；（7）割膠純化連接好的cDNA片段（一般回收200-500bp之間的片段）；（8）利用高保真聚合酶擴(kuò)增測(cè)序文庫(kù)；（9）檢測(cè)測(cè)序文庫(kù)。對(duì)于測(cè)序文庫(kù)，需要進(jìn)行質(zhì)量控制，一般通過 Aligent Technologies 2100分析儀和電泳觀察兩種方法檢測(cè)測(cè)序文庫(kù)的大小，純度及濃度。

8、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的影響因素？ 

答：RNA的降解嚴(yán)重影響測(cè)序的質(zhì)量，RNA降解后，加入poly-A后無法捕獲純化mRNA，因此，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄無法得到全部的cDNA，導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)明顯的3‘-和5’-偏向。文庫(kù)中的poly-A多聚物的存在會(huì)對(duì)測(cè)序信號(hào)產(chǎn)生干擾，影響測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時(shí)由于轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)錄本的豐度不一致，實(shí)驗(yàn)前需要對(duì)樣本進(jìn)行均一化處理，否則高豐度的表達(dá)基因會(huì)掩蓋低豐度表達(dá)基因，導(dǎo)致尋找新基因失敗或者是獲得大量無意義的重復(fù)序列。  

9、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序需要多大的測(cè)序量才能得到有意義的結(jié)果？ 

答：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序前，需要對(duì)物種轉(zhuǎn)錄組的大小進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估方法如下： （1）對(duì)于有reference genome的物種，可以分析基因組信息，統(tǒng)計(jì)編碼基因的個(gè)數(shù)，及其堿基數(shù)，從而估計(jì)物種轉(zhuǎn)錄組的大小，另外可以查詢相關(guān)或相近物種轉(zhuǎn)錄組研究的文獻(xiàn)，作為參考。 
（2）對(duì)于無reference genome的物種則只能參考相近物種的轉(zhuǎn)錄組大小。 
由于轉(zhuǎn)錄組需要進(jìn)行表達(dá)量的分析，因此在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中不推薦覆蓋度，在進(jìn)行不同基因和不同實(shí)驗(yàn)間的基因表達(dá)差異分析時(shí)，人們提出了RPM和RPKM的概念。 RPM（Reads Per Million reads）即每百萬reads中來自于某基因的reads數(shù)，考慮了測(cè)序深度對(duì)讀段計(jì)數(shù)的影響。RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads）是每百萬reads中來自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)。因此，在確定轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序量時(shí)，最好以產(chǎn)生的讀長(zhǎng)數(shù)目做依據(jù)，參照轉(zhuǎn)錄組大小，估計(jì)需要的讀長(zhǎng)數(shù)目，來確定轉(zhuǎn)錄組需要的測(cè)序量。  

10、如何處理轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中存在的系統(tǒng)噪音和偏差？ 

答：雖然深度測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性較以前的技術(shù)有了很大提高，但仍然存在錯(cuò)誤和噪聲。比如內(nèi)含子區(qū)內(nèi)有一些不連續(xù)的reads，很可能由系統(tǒng)噪聲造成，如樣品污染、測(cè)序錯(cuò)誤和不恰當(dāng)?shù)膔ead定位策略等。另外，外顯子區(qū)域內(nèi)的read信號(hào)分布有時(shí)也很不均勻。有文獻(xiàn)報(bào)道，序列組成尤其是GC含量、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等也有可能是導(dǎo)致read不均勻分布的原因。這些噪聲和分布偏好將影響新基因的識(shí)別和對(duì)剪接異構(gòu)體形式和表達(dá)水平推斷。 合理地建模RNA-seq數(shù)據(jù)中的系統(tǒng)噪聲和偏好是解決上述問題最有效的辦法?；镜乃悸房梢允牵菏紫雀鶕?jù)實(shí)驗(yàn)原理尋找可能產(chǎn)生系統(tǒng)噪音或偏差的因素，并盡可能將這些因素轉(zhuǎn)化成可量化的特征，如序列特征、二級(jí)結(jié)構(gòu)等；然后，將用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)這些特征做統(tǒng)計(jì)分析，構(gòu)造和訓(xùn)練模型，用模型來對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。需要注意的是，某些偏好是由當(dāng)前的測(cè)序技術(shù)和分析方法共同造成的，難以完全消除。在這種情況下，后續(xù)處理和解釋時(shí)需要充分意識(shí)到這種偏好可能對(duì)生物學(xué)結(jié)論帶來的影響，必要時(shí)通過補(bǔ)充其他實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證和修正通過高通量測(cè)序得到的生物結(jié)論。