層析技術(shù)介紹

一、概念

利用混和物中各組分理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀、大小、分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)）的差異，在物質(zhì)經(jīng)過(guò)兩相中進(jìn)行分離的一種技術(shù)。

本世紀(jì)初（1903年），俄國(guó)植物學(xué)家M.C.Jber發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素，還含其他色素，實(shí)際上他使用的吸附層析?，F(xiàn)在層系法已成為生化、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離、分析工具之一。

二、原理

具體過(guò)程：可分離物質(zhì)：糖類(lèi)、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸。

三、分類(lèi)

1.  按兩相所處物理狀態(tài)分類(lèi)

氣相層析：氣液層析（固定相為液體）和氣固層析（固定相為固體），流動(dòng)相為氣體。

液相層析：液液層析（固定相為液體）和液固層析（固定相為固體），流動(dòng)相為液體。

2.  按層析方式分類(lèi)

柱層析：固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向移動(dòng)而分離。

薄層層析：將適當(dāng)粘度的固定相均勻鋪在薄板上，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)。

紙層析：用濾紙作液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開(kāi)。

3.  根據(jù)層析原理分類(lèi)：常用分類(lèi)法

（1）吸附層析：固定相是固體吸附劑，通過(guò)對(duì)不同溶質(zhì)吸附力強(qiáng)弱不同進(jìn)行分離。

（2）分配層析：利用兩相中的分配系數(shù)不同。

 分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)，即分配系數(shù)（Kd）

  Kd＝Ca / Cb

Ca和Cb分別代表某一物質(zhì)在互不相溶的兩相，A相（動(dòng)相）和B相（靜相）中的濃度。

（3）離子交換層析：固定相是離子交換劑，各組分與其親和力不同

（4）凝膠層析：固定相是多孔凝膠，根據(jù)流動(dòng)相中溶質(zhì)的分子量大小差異進(jìn)行分離

（5）親和層析：利用固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基，與溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合進(jìn)行分離

（6）金屬螯合層析

（7）疏水層析

（8）反相層析

四、凝膠層析（又叫凝膠過(guò)濾或分子篩）

凝膠層析是指混和物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其分子大小不同而被分類(lèi)的技術(shù)。

1.  原理

凝膠層析的固定相是凝膠。凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個(gè)顆粒內(nèi)部都具有很多細(xì)微的小孔，如同篩子一樣。常用凝膠有瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠等。

葡聚糖凝膠介質(zhì)是由多聚葡聚糖與環(huán)氧綠丙烷交連而成。最常用的葡聚糖凝膠層析介質(zhì)是Sephadex G系列，不同型號(hào)的凝膠用G表示，G代表交聯(lián)度，從G10到G100。“G”后面的數(shù)字表示每10g干膠的吸水量，可根據(jù)待分離混和物分子量大小選用不同“G”值的凝膠。

2.  分離過(guò)程：

樣品隨洗脫液的流動(dòng)下移

3.  影響凝膠柱層析的主要因素

（1）層析柱的選擇與裝填

 層析柱的大小應(yīng)根據(jù)分離樣品量的多少及對(duì)分辨率的要求而定。凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無(wú)紋路、無(wú)汽泡。

（2）流動(dòng)相――洗脫液的選擇：是含有一定濃度鹽的緩沖液，目的是為了防止凝膠可能有吸附作用。其選擇主要取決于待分離樣品，一般來(lái)說(shuō)只要能溶解洗脫物質(zhì)，并不使其變性的緩沖液都可用于凝膠層析。

（3）加樣量：加樣量的多少應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)而定：一般分級(jí)分離時(shí)加樣量約為凝膠柱床體積的1％－5％，而分組分離時(shí)加樣量約為凝膠柱床體積的10%-25%.

（4）凝膠再生：葡聚糖凝膠再生使用NaOH（0.2M）和NaCl(0.5M)混合液處理。

五、離子交換層析

離子交換層析是利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團(tuán)和流動(dòng)相解離的離子化合物之間發(fā)生可逆的離子交換反應(yīng)而進(jìn)行的分離方法。

1.  原理

離子交換交換層析是利用離子交換劑對(duì)各種離子的親和力不同，借以分離混和物中各種離子的一種技術(shù)。其主要特點(diǎn)是依靠帶有相反電荷的顆粒之間的吸引力的作用。

離子交換層析的固定相是載有大量電荷的離子交換劑，流動(dòng)相是具有一定pH值和一定離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液。

離子交換劑按其所帶電荷性質(zhì)，分為：

陰離子交換劑帶正電荷，與混合物中帶負(fù)電的組分結(jié)合 陰離子交換層析。

陽(yáng)離子交換劑 帶負(fù)電荷，與混合物中帶正電的組分結(jié)合 陽(yáng)離子交換層析。

常用離子交換劑有：離子交換樹(shù)脂，離子交換纖維素等