分層組裝的DNA線框納米結(jié)構(gòu)，可用于癌癥高效成像和靶向治療

1.DNA八面體線框的分層自組裝

作者首先獲得了單鏈CA4-FS，接下來通過分層自組裝策略構(gòu)建了一個(gè)DNA八面體。采用可編程退火的方法，構(gòu)建了6個(gè)四通連接DNA塊作為DNA八面體的頂點(diǎn)。然后DNA塊通過它們的單鏈結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成一個(gè)DNA八面體線框。優(yōu)化了構(gòu)建條件后，驗(yàn)證了由DNA塊逐步組裝的DNA八面體（圖1a）。AFM成像證實(shí)了八面體的形態(tài)（圖1b）。為了證明藥物負(fù)載的可調(diào)性，作者構(gòu)建了具有不同手柄數(shù)的DNA八面體用于與CA4-FS雜交。

這種DNA八面體的可尋址性和可預(yù)見性允許地裝載不同數(shù)量的單鏈CA4-FS。作為概念驗(yàn)證，作者構(gòu)建了半負(fù)載CA4-八面體（hCA4-Oct）和全負(fù)載CA4-Oct，并測(cè)定了負(fù)載效率（圖1c）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證hCA4-Oct和CA4-Oct的可編程組裝，作者接下來分別用Cy3標(biāo)記的Oct-12H、Cy3標(biāo)記的Oct-24H和Cy5標(biāo)記的CA4-FS研究了CA4-Oct的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)。正如預(yù)期的那樣，hCA4-Oct和CA4-Oct均顯示出明顯的FRET信號(hào)。八面體水動(dòng)力尺寸為17.0±1.1nm，功能Oct-12H和Oct-24H的水動(dòng)力尺寸分別為24.9±3.0和26.5±3.4nm。hCA4-Oct的大小為29.5±3.2nm，CA4-Oct的大小為30.1±3.7nm（圖1d）。AFM成像也證實(shí)了hCA4-Oct和CA4-Oct的形成。這一結(jié)果表明CA4-FS指向DNA八面體核的外側(cè)，形成三層核-殼納米組裝體。上述結(jié)果證明了在DNA八面體上可以地裝載多個(gè)游離藥物分子。

2.細(xì)胞內(nèi)化與腫瘤球體穿透

為了最大限度地負(fù)載CA4-FS，接下來的研究選擇了一個(gè)完全負(fù)載CA4修飾的DNA八面體。圖2a，b結(jié)果證明了通過修飾DNA納米結(jié)構(gòu)上的適配體增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)化。競(jìng)爭(zhēng)性阻斷實(shí)驗(yàn)也支持了這一結(jié)論。CA4-Oct的位移大于CA4-FS?；谏鲜鼋Y(jié)果，作者推斷，內(nèi)化增強(qiáng)的因素有：（i）識(shí)別單元增加（24 CA4-FS vs 1 CA4-FS）；（ii）八面體結(jié)構(gòu)的剛度；（iii）提高CA4-Oct的穩(wěn)定性。對(duì)于穩(wěn)定性因子的重要作用，作者測(cè)試了CA4-Oct和CA4-FS在10%胎牛血清中的生物穩(wěn)定性。8小時(shí)處理后，CA4-Oct保持不變，但55%的CA4-FS被降解。所以CA4-Oct的內(nèi)化速率比CA4-FS的內(nèi)化速率要快（圖2b）。CA4-Oct和CA4-FS在無FBS培養(yǎng)基中保持了相同的完整性，表現(xiàn)出了相同的時(shí)間依賴性內(nèi)化速率，進(jìn)一步說明了至關(guān)重要的穩(wěn)定因子減緩了CA4-FS的時(shí)間依賴性內(nèi)化。

為了研究細(xì)胞選擇性，作者還檢測(cè)了PTK7陰性的NCM460細(xì)胞（正常結(jié)直腸細(xì)胞系）。與NCM460細(xì)胞相比，CA4-Oct和CA4-FS對(duì)HCT116細(xì)胞的吸收更多（圖2c）。值得注意的是，與單鏈CA4-FS相比，CA4-Oct對(duì)HCT116細(xì)胞和NCM460細(xì)胞間CA4傳遞的細(xì)胞內(nèi)化選擇性要大得多（圖2d）?？梢暬簿劢钩上褚沧C實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明CA4-Oct比單鏈CA4-FS具有更多的細(xì)胞內(nèi)化和選擇性。為研究CA4在實(shí)體腫瘤組織中的遞送深度，制備HCT116三維多細(xì)胞腫瘤球形體。與單鏈CA4-FS相比，CA4-Oct在腫瘤球狀體中心有更高的強(qiáng)度（圖2e）。這些發(fā)現(xiàn)支持了適配體殼由于其識(shí)別和結(jié)合作用而起主導(dǎo)作用的假說，以及DNA八面體核促進(jìn)CA4-FS在腫瘤組織中的插入。

3.靶向性細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性

在鑒定了CA4-Oct的細(xì)胞內(nèi)化和穿透能力后，作者測(cè)定了其對(duì)目標(biāo)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。為了研究適配體介導(dǎo)的靶向給藥的影響，作者選擇了8h的短期孵育和40h的額外孵育，將抗癌功能從非特異性細(xì)胞吸附和核溶解中分離出來。作者發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組Sgc8c、Lib、CA4-Lib、DNA八面體和CA4-Lib-Oct對(duì)HCT116細(xì)胞沒有或可忽略的細(xì)胞毒性（圖3a）。正如預(yù)期的那樣，CA4-Oct比CA4-FS對(duì)HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出更高的抑制細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)CA4-Oct的細(xì)胞特異性毒性，作者還比較了對(duì)HCT116和NCM460細(xì)胞的毒性。如圖3a所示，在孵育48小時(shí)后（預(yù)處理8小時(shí)后洗），除CA4外，所有組對(duì)NCM460細(xì)胞都沒有表現(xiàn)出或可以忽略不計(jì)的細(xì)胞毒性。基于這些結(jié)果，CA4-Oct通過包裹CA4-FS表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，從而表現(xiàn)出選擇性細(xì)胞毒性。

接下來，作者將培養(yǎng)時(shí)間增加到48小時(shí)，以評(píng)估DNA序列潛在的不穩(wěn)定性介導(dǎo)的降解所導(dǎo)致的脫靶風(fēng)險(xiǎn)的可能性?；趫D3a研究結(jié)果，作者認(rèn)為顯著提高CA4-Oct的核酸酶抗性可以顯著緩解單價(jià)CA4-FS的脫靶效應(yīng)，從而獲得更好的安全性。

為了進(jìn)一步系統(tǒng)地揭示CA4-Oct的靶向細(xì)胞毒性，作者構(gòu)建了細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬藥物對(duì)體內(nèi)多細(xì)胞共存環(huán)境的現(xiàn)實(shí)影響。在本研究中分別用CA4-Oct或CA4-FS處理轉(zhuǎn)染了GFP的HCT116（GFP陽性）和NCM460（GFP陰性）的共培養(yǎng)體系（1:1，Q3/Q4，圖3b）。在未經(jīng)任何處理的孵育4h后，由于癌細(xì)胞的惡性增殖，活癌細(xì)胞與正常活細(xì)胞的比率（RCN）約為2:1（圖3c）。短期治療（8h沖洗后），CA4-Oct組RCN變?yōu)?:4，CA4-FS組RCN僅為1:2（圖3d，e）。除抑制增殖外，CA4-Oct殺死約60%的HCT116細(xì)胞，而CA4-FS僅殺死45%（(Q2/（Q2+Q3)，圖3d，e）。同時(shí)，CA4-FS和CA4-Oct導(dǎo)致正常細(xì)胞凋亡率較低（Q1/(Q1+Q4)，圖3d，e）。在長(zhǎng)期治療（不洗滌）中，CA4-FS殺死了52%的NCM460細(xì)胞，盡管它誘導(dǎo)了71%的HCT116細(xì)胞凋亡（圖3g）。然而，CA4-Oct也能殺死71%的HCT116細(xì)胞，但僅能引起28%的NCM460細(xì)胞凋亡（圖3f）。因此，CA4-FS和CA4-Oct的RCNs分別約為1:3和1:5。顯然，由于細(xì)胞外血清穩(wěn)定性的差異，CA4-FS的脫靶不良反應(yīng)比CA4-Oct嚴(yán)重的多。這些結(jié)果表明，DNA八面體增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的靶向細(xì)胞毒性，降低了正常細(xì)胞的不穩(wěn)定性介導(dǎo)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

4.活體成像分析

在良好的體外表現(xiàn)的鼓舞下，作者實(shí)施了體內(nèi)評(píng)估。首先，將Cy5標(biāo)記的CA4-Oct、Cy5標(biāo)記的CA4-FS和游離的Cy5分別靜脈注射到SD大鼠，通過追蹤眼眶靜脈血熒光信號(hào)來評(píng)價(jià)它們的藥代動(dòng)力學(xué)。補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持Cy5在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)超出說明以外的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，攜帶CA4的CA4-Oct比單鏈CA4-FS的血液濃度和循環(huán)時(shí)間要高得多。

CA4-FS組在注射后4和8小時(shí)腫瘤部位顯示出更亮的Cy5信號(hào)，但在注射后12小時(shí)顯示出非常微弱的熒光信號(hào)（圖4a）。但CA4-Oct組在注射后第1天熒光信號(hào)仍然很亮。同時(shí)處死小鼠進(jìn)行離體分析，評(píng)價(jià)其生物分布。靜脈給藥后12h，Cy5和CA4-FS主要分布在腎臟，而CA4-Oct在腫瘤部位表現(xiàn)出超過24h的強(qiáng)烈熒光信號(hào)（圖4b）。

為了進(jìn)一步確定CA4-Oct在實(shí)體瘤組織中是否具有優(yōu)越的聚集能力和穿透能力，作者收集CA4-Oct組和CA4-FS組的腫瘤組織進(jìn)行切片分析。CA4-Oct組在各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的Cy5信號(hào)均比CA4-FS組更亮（圖4c，d），說明CA4-Oct具有更強(qiáng)的聚集能力，能夠?qū)⒏嗟腃A4藥物傳遞到腫瘤組織。從CA4-FS與FITC標(biāo)記的血管生物標(biāo)志物CD31共定位結(jié)果來看，CA4-FS大多數(shù)分布在腫瘤血管內(nèi)部或周圍（圖4d）。相比之下，大多數(shù)CA4-Oct穿過腫瘤血管，到達(dá)腫瘤組織（圖4c），這將有利于深部給藥。多價(jià)、致密、剛性的CA4-Oct確實(shí)增強(qiáng)了單鏈CA4-FS的穿透能力及其在實(shí)體腫瘤組織中的治療潛力。

5.體內(nèi)靶向癌癥治療

圖像表征完成后，作者在HCT116荷瘤異種移植小鼠中進(jìn)行了抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象。經(jīng)5次靜脈給藥（接種腫瘤后第18天），CA4-Oct、CA4-FS、CA4組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)到86%、65%、46%（圖5a）。但一旦停止給藥，CA4-Oct的抑瘤率仍維持在85%左右，而CA4-FS組和CA4組的抑瘤率進(jìn)一步下降，分別降至54%和30%（第32天）。這可能是由于CA4-Oct滲透深度較深，滯留時(shí)間較長(zhǎng)所致。此外，體外腫瘤重量和腫瘤圖像均表明CA4-Oct是作為靶向藥物的選擇（圖5b，c）。為了評(píng)估治療的安全性，作者首先監(jiān)測(cè)了這些小鼠的體重變化。由于全身分布的副作用，CA4處理的小鼠體重明顯減輕（約7%）（圖5d）。與CA4-Oct組相比，CA4-FS組體重增長(zhǎng)也下降了6%。第32天取臟器稱重，評(píng)價(jià)藥物對(duì)健康組織的可能損傷。與PBS組和CA4-Oct組相比，CA4和CA4-FS組肝臟異常增重更為嚴(yán)重（圖5e）。對(duì)這個(gè)解毒器官的損害可能是歸因于CA4-FS的脫靶毒性和CA4的非選擇性毒性。為了進(jìn)一步闡明CA4-Oct治療的有效性和安全性，作者采集腫瘤組織、主要臟器和血液進(jìn)行更詳細(xì)的研究。CA4-Oct顯示TUNEL陽性細(xì)胞（TUNEL+）有約65%的凋亡，而CA4-FS和CA4僅顯示35%和20%的殺傷能力（圖5f）。與CA4-FS組和CA4組相比，增殖標(biāo)記Ki67信號(hào)顯示CA4-Oct對(duì)腫瘤增殖的抑制作用（圖5g）。

接下來作者也采集了相同條件下未接種腫瘤的正常小鼠的正常器官和血液。首先，作者研究了可能的肝毒性，因?yàn)镃A4可以引起肝痛。與未接種腫瘤的正常組相比，PBS組肝內(nèi)淋巴細(xì)胞輕微浸潤(rùn)，但給藥CA4-Oct減輕了這種趨勢(shì)（圖5h）。PBS和CA4-Oct均未顯示明顯的肝細(xì)胞死亡。CA4-FS組肝細(xì)胞局部壞死，肝星狀細(xì)胞增生。在小鼠肝臟中央靜脈周圍觀察到局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5h）。更嚴(yán)重的是CA4給藥后肝細(xì)胞大面積斑片狀壞死，HSCs增生更為明顯。CA4組可見許多中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶異常升高也證實(shí)了這一趨勢(shì)。這些結(jié)果顯示CA4-FS和CA4的肝毒性水平不同，而CA4-Oct顯示出一定的潛在安全性。

然后作者評(píng)估各組腎臟的HE染色切片的組織病理學(xué)。與正常組比較，PBS組與CA4-Oct無明顯差異（圖5i）。然而，CA4-FS給藥后，可以看到腎小管刷狀緣局灶性脫落和輕微的細(xì)胞腫脹。在游離CA4組中，除了明顯的細(xì)胞脫落和腫脹外，還發(fā)現(xiàn)血清肌酐明顯升高，間質(zhì)水腫伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5i）。這些結(jié)果表明，適配體修飾緩解了CA4的腎臟損傷，而DNA八面體保護(hù)CA4-FS免于靶CA4外溢至腎臟組織。

作者繼續(xù)檢查其他的生化和血液學(xué)數(shù)據(jù)。與正常組和PBS組比較，CA4-Oct組CK無明顯升高，而CA4-FS組和CA4組CK有不同程度升高。說明CA4-FS和CA4可造成不同程度的心臟損傷。也有報(bào)道稱游離CA4可引起血小板減少癥。CA4確實(shí)導(dǎo)致血小板明顯減少，但CA4-FS和CA4-Oct組未見損傷。另一個(gè)不一致的指標(biāo)是白細(xì)胞（WBCs）的數(shù)量。令人驚訝的是，與正常組相比，CA4-Oct組的WBCs沒有明顯升高，而PBS、CA4-FS和CA4組的WBCs明顯升高。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步說明PBS、CA4-FS和CA4可能導(dǎo)致潛在的炎癥和骨髓抑制。只有CA4-Oct的抗癌方案可以獲得有效的治療，且具有足夠的生物安全性。不幸的是，作者并沒有從心臟、肝臟和脾臟的HE切片評(píng)估中發(fā)現(xiàn)CA4-Oct的其他優(yōu)勢(shì)。此外，除CA4外，其他各組均未誘導(dǎo)免疫反應(yīng)指標(biāo)明顯升高。