質粒DNA提取、純化和鑒定

一、實驗原理

     細胞破碎后，染色體DNA和質粒DNA均被釋放出來，但兩者變性與復性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達12.0的堿性溶液中，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性；共價閉合環(huán)狀質粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離。當用pH值4.6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質粒DNA可恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結構而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復性的溶于溶液的質粒DNA分離。溶于上清的質粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNase A將RNA降解。質粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯fang抽提除去，最后獲得純度較高的質粒DNA。

    簡言之：在細胞破碎后，染色體DNA和質粒DNA 釋放到溶液中，當PH為12時，DNA的氫鍵斷開，由于質粒DNA為環(huán)狀結構，所以兩條鏈沒有分離，而染色體DNA兩條鏈完全分開，氫鍵斷開而分離。當PH值恢復到中性時，質粒DNA恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結構而溶解于溶液中-------------除去染色體DNA、大分子RNA和蛋白質-SDS復合物纏連成白色絮狀沉淀，離心分離。

加入乙醇后，上清質粒DNA凝聚成沉淀，會有RNA存在，加入RNA酶，使RNA降解。---------------去除RNA分子。

二、實驗儀器

     微量取液器（20、200、1000微升）、臺式高速離心機、恒溫震蕩搖床、高速蒸汽消毒器（滅菌鍋）、渦旋震蕩器、電泳儀、瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。

三、實驗步驟

    堿變性法提取質粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細菌細胞以擴增質粒；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。

①細菌的培養(yǎng)和收集

將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數生長后期。 (培養(yǎng)箱、搖床)

②質粒DNA少量快速提取   

1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。（移液器、離心機）   

2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數分鐘,使液體流盡。     

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。（移液器）     

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。（移液器）    

5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。 （移液器、離心機）     

6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯fang(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。 

7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。 （冰箱、離心機）    

8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。     

9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。     

10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。

* 溶液一：重懸菌體，提供緩沖環(huán)境。

  溶液二：氫氧化鈉和SDS裂解菌體細胞壁、在細胞膜上穿孔，釋放細胞內的質粒。

  溶液三：中和氫氧化鈉、SDS中的鈉被鉀替換，吸附菌體產生沉淀。

 ③DNA鑒定

實驗儀器

   恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，旋渦振蕩器，水浴鍋，1.5mL離心管，50mL離心管，不同型號的吸頭，微量移液器，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，電子天平，手套，紫外燈，Eppendorf管等。 

DNA純度檢測

（1） 取40mLTAE（1×）于300mL錐形瓶中，加入0.4g瓊脂糖，放入微 波爐內使其熔化，60℃時倒入準備好的制膠槽中。（微波爐、制膠槽、梳子）  

（2） 取5.0μl純化DNA加入1.0μl上樣緩沖液，混合，進行點樣。（移液器、電泳儀） 

（3） 點樣完畢后，100V，200mA條件下電泳30min。  

（4） 電泳完畢后，進行EB染色，用凝膠成像儀拍照，得到實驗結果。（凝膠成像系統(tǒng)）