Inscopix顯微成像技術(shù)驗(yàn)證食物偏好的大腦里處理機(jī)制

度過物資匱乏的年代，享受生活成了的主流，人類創(chuàng)造出出了極其豐富璀璨的美食文化，并在當(dāng)下得到了異常繁榮的發(fā)展。我們有分辨五味的能力，但同一種味道，兩個(gè)人分辨出來的感覺是一樣的嗎？答案是否定的。每個(gè)人因?yàn)楦髯蕴赜械囊恍┥窠?jīng)和生物感知上的細(xì)微差別，感知的味道是不完全相同的；并且我們對于食物的喜好的復(fù)雜度似乎是超越味覺的，同樣都是甜的或辣的東西，我們的味覺卻有完全不同、極為豐富的感知。

這些對食物選擇的偏好在我們的大腦里有什么樣的處理機(jī)制呢?

最近，里斯本Champalimaud研究中心Fernandes等科學(xué)家在《neuron》雜志上發(fā)表了一篇名為“Postingestive Modulation of Food Seeking Depends on Vagus-Mediated Dopamine Neuron Activity”的文章，科研人員使用了由格羅貝爾引進(jìn)中國并始終為中國代理的inscopix nVoke2.0在體自由動(dòng)物神經(jīng)元成像設(shè)備對小鼠進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)和分析，嘗試解密這個(gè)大腦處理機(jī)制。

科學(xué)家們通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小鼠食用蔗糖的攝食后反饋是否可以導(dǎo)致攝食行為，即是否可以誘導(dǎo)調(diào)控小鼠開啟蔗糖開關(guān)，饑餓的小鼠在經(jīng)過訓(xùn)練學(xué)會(huì)了通過按壓開關(guān)如何選擇獲得蔗糖和三氯蔗糖（一種無熱量的甜味劑）溶液（F1A）。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，最初小鼠對兩種溶液的取食次數(shù)相似，但隨著時(shí)間推移，對蔗糖的取食次數(shù)逐漸增加，說明蔗糖引起的攝食后反饋會(huì)促使小鼠更多的索取蔗糖。為了驗(yàn)證蔗糖的攝食后反饋不靠口感也足以驅(qū)動(dòng)取食行為，科學(xué)家將小鼠植入了胃導(dǎo)管以進(jìn)行蔗糖和三氯蔗糖的長期刺激。利用經(jīng)過訓(xùn)練并隨時(shí)剝奪小鼠開啟開關(guān)以進(jìn)行胃內(nèi)注射食物，同時(shí)在口部攝取清水，觀察到開啟頻率增高很多。小鼠控制開關(guān)可以在嘴邊獲得清水，并同時(shí)會(huì)往胃里注入蔗糖溶液，小鼠會(huì)加劇地開啟開關(guān)。與之相反，如果胃里注入的是三氯蔗糖，則開啟頻率沒有升高。在另一組小鼠中，相似的訓(xùn)練但同時(shí)控制2個(gè)開關(guān)，來選擇往胃里注入蔗糖或三氯蔗糖，小鼠沒有通過味覺感知也自行適應(yīng)出了往胃里注入蔗糖溶液的偏好。說明小鼠能隨機(jī)感覺出攝食動(dòng)作和他們的攝食后結(jié)果的差別。為了驗(yàn)證這種偏好不是由甜味口感刺激驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的，研究人員使用Trpm5 敲除小鼠，這種小鼠不能感受甜味。實(shí)驗(yàn)結(jié)果依然是偏好蔗糖而不是三氯蔗糖，證明了這些行為是由于受營養(yǎng)物質(zhì)的取食后反饋誘導(dǎo)而不是甜味感受器的介導(dǎo)。

F1，蔗糖的攝食后效應(yīng)調(diào)控索食行為

接下來，研究人員對蔗糖攝食反饋增強(qiáng)索食行為的主要機(jī)制進(jìn)行了研究。之前已經(jīng)有研究證明飼喂誘導(dǎo)的紋狀體中多巴胺釋放可以不通過味覺感知而被攝食后反饋來驅(qū)動(dòng)。但是，還沒有證明攝食后反饋對多巴胺能神經(jīng)元活動(dòng)有直接影響。

為了探討腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）多巴胺能神經(jīng)元對攝食后增強(qiáng)索食行為的是否有潛在影響，研究人員在每日偽隨機(jī)順序進(jìn)行蔗糖或三氯蔗糖胃內(nèi)灌注，并在同時(shí)對自由活動(dòng)小鼠的VTA多巴胺能神經(jīng)元活性進(jìn)行了監(jiān)測。他們使用深部腦區(qū)鈣成像技術(shù)在4只DATIRES: Cre小鼠中測量了VTA多巴胺神經(jīng)元活性（圖2A，2B）。

使用inscopix公司的nVista微型顯微成像設(shè)備，可以在小鼠進(jìn)行攝食行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)及其自由活動(dòng)期間對其大腦內(nèi)的神經(jīng)鈣活動(dòng)信號進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察及記錄，整個(gè)顯微鏡埋植在小鼠頭骨上，由一根自聚焦透鏡深入腦內(nèi)部，可以對深部腦區(qū)紋狀體甚至最下面的乳頭體進(jìn)行細(xì)致精確的觀察。透鏡有0.5mm、0.6mm、1mm直徑的選擇，整個(gè)透鏡重約2克，小鼠完全可以清醒狀態(tài)下進(jìn)行取食及各種自由行為活動(dòng)。根據(jù)調(diào)整內(nèi)部液體透鏡的電子對焦，其焦平面變化可變范圍達(dá)300微米，借助鈣指示病毒表達(dá)的綠色熒光蛋白可以清晰顯示神經(jīng)元胞體、軸突的脈沖式鈣活動(dòng)，反映神經(jīng)環(huán)路中的具體實(shí)時(shí)活動(dòng)。配套的軟件可以自動(dòng)的對活動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行識(shí)別統(tǒng)計(jì)，集成的算法可視化的對每次活動(dòng)進(jìn)行強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)。

實(shí)驗(yàn)中，平均每只動(dòng)物每天記錄19個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)。在活動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量上，蔗糖組和三氯蔗糖組沒有顯著差異（圖2C）。但相對于三氯蔗糖，胃內(nèi)輸注蔗糖后，活動(dòng)上調(diào)的神經(jīng)元比例顯著增加（圖2D），而且這些被蔗糖上調(diào)的神經(jīng)元持續(xù)活動(dòng)時(shí)間相對于基線水平更長（圖S2B），那些活動(dòng)下調(diào)的神經(jīng)元未發(fā)現(xiàn)活動(dòng)持續(xù)的差異（圖S2C）。

在對最后一個(gè)蔗糖攝入階段和隨后的三氯蔗糖攝入階段記錄的40個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行分析時(shí)，結(jié)果得到了證實(shí)，相對于三氯蔗糖，神經(jīng)元對蔗糖的反應(yīng)明顯更大，與三氯蔗糖相比，蔗糖正調(diào)的神經(jīng)元更多。對最后一個(gè)蔗糖攝入階段和前期的三氯蔗糖攝入階段記錄的神經(jīng)元進(jìn)行分析時(shí)，結(jié)果是一致的。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，在蔗糖和三氯蔗糖攝入時(shí)進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)測量顯示沒有差異，表明運(yùn)動(dòng)不是兩者VTA多巴胺神經(jīng)活動(dòng)出現(xiàn)差異的原因。

這些數(shù)據(jù)表明，蔗糖的攝食后效應(yīng)足以在VTA多巴胺能神經(jīng)元中誘導(dǎo)出現(xiàn)持續(xù)的活性。

F2，胃內(nèi)蔗糖遞送可以激活VTA多巴胺能神經(jīng)元

為了測試VTA多巴胺能神經(jīng)元活動(dòng)對于攝食后索食是否必要，研究人員制作了NMDA依賴的條件性控制多巴胺能神經(jīng)元burst活動(dòng)的小鼠，可誘導(dǎo)其對預(yù)期獎(jiǎng)勵(lì)刺激和學(xué)習(xí)的活動(dòng)響應(yīng)降低及神經(jīng)可塑性的改變。

并制作了Th-Cre小鼠來實(shí)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞類型和分布的特異性，該小鼠主要在VTA的表達(dá)酪氨酸羥化酶基因的神經(jīng)元中表達(dá)Cre重組酶。

酪氨酸羥化酶和GFP的雙重免疫染色證實(shí)Cre重組主要在VTA的多巴胺能神經(jīng)元中，部分發(fā)生在黑質(zhì)中，在LC中僅是很少量表達(dá)。

科學(xué)家們正是利用Inscopix nVista，nVoke系例設(shè)備，可以滿足任何形式的大腦神經(jīng)元，神經(jīng)環(huán)路研究，對自由狀態(tài)下的小鼠大腦內(nèi)如煙花般的神經(jīng)脈沖電流進(jìn)行真實(shí)準(zhǔn)確的記錄！

然后將Th-Cre小鼠與攜帶可剪切NMDA受體NR1亞基的小鼠Grin1-Flox雜交，子代小鼠的TH神經(jīng)元中具有NR1 缺失（KO），我們將其稱為Th-CreNR1KO小鼠。為了驗(yàn)證這些小鼠中特定類型細(xì)胞的NMDAR缺失，我們在新鮮腦切片中進(jìn)行了whole-cell記錄，測量電刺激誘發(fā)的NMDAR介導(dǎo)興奮性突觸后電流。在Th-CreNR1KO小鼠中，僅在記錄的22個(gè)VTA多巴胺能細(xì)胞中的1個(gè)細(xì)胞里檢測到INMDA，而在對照小鼠中，在所有VTA多巴胺能和LC去甲腎上腺素神經(jīng)元中都檢測到了INMDA（圖3C和3D）。與GFP報(bào)告基因小鼠的結(jié)果一致，在Th-CreNR1KO小鼠中，在記錄的32個(gè)SNc多巴胺能神經(jīng)元中有11個(gè)神經(jīng)元檢測到了INMDAs，9個(gè)LC去甲腎上腺素神經(jīng)元中有8個(gè)檢測到了INMDA，這表明LC大部分NMDAR被保留，SNc部分受到影響，但比VTA范圍要小。

為了評估清醒和自由移動(dòng)的小鼠中VTA多巴胺神經(jīng)元的burst活動(dòng)，他們在VTA中植入多電極微線陣列，根據(jù)測量得到的波形，基礎(chǔ)放電速率和對多巴胺D2受體激動(dòng)劑quinpirole的敏感性反應(yīng)，記錄了被推定為多巴胺能神經(jīng)元的活動(dòng)（圖3E和3F）。在基線水平時(shí)，Th-CreNR1KO小鼠在VTA多巴胺能神經(jīng)元的burst數(shù)量和激發(fā)尖峰均較少，說明小鼠被削弱了對獎(jiǎng)勵(lì)預(yù)期刺激的反應(yīng)。然后，他們對ThCreNR1KO小鼠進(jìn)行如上實(shí)驗(yàn)，測定它胃內(nèi)注入蔗糖后增強(qiáng)索食行為的能力是否受損（圖3I）。

如同預(yù)期，在對照組中，胃內(nèi)蔗糖比胃內(nèi)三氯蔗糖使小鼠產(chǎn)生更多的啟動(dòng)開關(guān)行為，而Th-CreNR1KO小鼠對胃內(nèi)蔗糖和三氯蔗糖兩組表現(xiàn)出相似的開關(guān)啟動(dòng)行為（圖3J）。結(jié)果表明依賴于NMDA的burst和多巴胺能VTA神經(jīng)元的可塑性對于蔗糖攝食后增強(qiáng)開關(guān)啟動(dòng)行為是必需的。

F3，VTA多巴胺能神經(jīng)元活動(dòng)對于攝食后調(diào)控的索食行為是必要的

盡管有大量的腦-腸功能軸的證據(jù)，但與攝食后營養(yǎng)關(guān)聯(lián)信號引起多巴胺能神經(jīng)元活動(dòng)和行為反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。有證據(jù)表明迷走神經(jīng)損傷會(huì)破壞風(fēng)味——營養(yǎng)調(diào)控，但其在營養(yǎng)調(diào)控中的作用仍存在爭議，并且還有激素影響營養(yǎng)物質(zhì)感應(yīng)的報(bào)道。鑒于先前的研究，肝迷走神經(jīng)（HVN）有可能擔(dān)負(fù)攝食后營養(yǎng)信息的傳導(dǎo)，我們測試了HVN的切斷是否影響蔗糖對VTA多巴胺能活性和強(qiáng)化索食的效應(yīng)。研究人員在3只DAT-IRES：Cre小鼠的HVN處進(jìn)行神經(jīng)切斷術(shù)，另3只接受假手術(shù)，進(jìn)行與前述相同的實(shí)驗(yàn)，用深部腦區(qū)鈣成像觀察測量胃內(nèi)注入蔗糖或三氯蔗糖期間VTA的多巴胺能活性。 HVN神經(jīng)切斷并不影響每只動(dòng)物每階段記錄的平均神經(jīng)元數(shù)量（圖4A）。如預(yù)期的那樣，實(shí)施假手術(shù)小鼠在蔗糖組與三氯蔗糖組相比，蔗糖組的VTA多巴胺能活性顯著增加（圖4B）。 假手術(shù)小鼠中，攝取蔗糖鼠的正調(diào)神經(jīng)元比例也更高（圖4C）。而在迷走神經(jīng)切斷鼠中，蔗糖和三氯蔗糖攝取鼠的VTA多巴胺能活性以及正調(diào)神經(jīng)元的比例沒有差異。跟蹤最后一個(gè)三氯蔗糖攝食階段和隨后的蔗糖攝食階段中記錄的每個(gè)單獨(dú)神經(jīng)元（圖4F，G），確定了在假手術(shù)鼠中，被蔗糖正調(diào)的神經(jīng)元比例相比三氯蔗糖大得多，而在神經(jīng)切斷鼠沒有出現(xiàn)同樣結(jié)果，導(dǎo)致蔗糖正調(diào)的神經(jīng)元在切斷組和假手術(shù)組有顯著不同（57％對32％；圖4H）。對于神經(jīng)切斷組，即使目視檢查單細(xì)胞多巴胺能活性表明蔗糖的作用持續(xù)時(shí)間更長（圖4G），但直接測量比較這些神經(jīng)元在蔗糖和三氯蔗糖攝食期的活性，卻并沒有顯示出顯著的增強(qiáng)劑作用。但是它揭示了一個(gè)顯著的時(shí)間——增強(qiáng)劑相互作用，這可能反映了胃內(nèi)蔗糖的不依賴HVN的殘留的效應(yīng)。

最后，我們在另一組C57Bl6/J小鼠中執(zhí)行了上述的攝食后行為強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)（圖4I），發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)小鼠相比，HVN切除小鼠對攝食后蔗糖的有明顯更少但沒有完全消失的開關(guān)控制行為（圖4J）。

這些結(jié)果證實(shí)，通過迷走神經(jīng)肝分支的信號傳導(dǎo)在VTA多巴胺能活性和索食行為的攝食后調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。

F4，索食和多巴胺神經(jīng)元活性的攝食后增強(qiáng)受迷走神經(jīng)肝分支的控制

特別聲明：

近期，有公司和個(gè)體不斷擾亂Inscopix中國市場，希望中國科研人員向Inscopix一進(jìn)入中國市場就選擇并始終為中國代理----格羅貝爾生物科技公司（美國Global Bietech Inc,）詳細(xì)咨詢、核實(shí)，辨別其他公司的實(shí)力、特別是技術(shù)團(tuán)隊(duì)能力，以免受損。