高效液相色譜儀器及技術(shù)進(jìn)展和有關(guān)問(wèn)題

我國(guó)目前的現(xiàn)狀是：做儀器的人，不知道使用者在如何使用儀器，不知道使用者對(duì)儀器的具體要求；而使用者不知道制造者在如何制造儀器，不知道儀器的性能指標(biāo)的物理意義、對(duì)分析誤差的影響。所以，不忘初心，牢記使命，制造儀器和使用儀器的科技工作者緊密結(jié)合非常重要。

本文簡(jiǎn)單介紹了高效液相色譜儀器和技術(shù)相關(guān)的進(jìn)展。

1，

HPLC儀器工作原理、結(jié)構(gòu)組成

HPLC的工作原理：樣品進(jìn)入輸液系統(tǒng)(泵) → 進(jìn)樣系統(tǒng) → 分離系統(tǒng)(柱)→檢測(cè)系統(tǒng) → 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)→打印輸出結(jié)果。

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結(jié)構(gòu)組成及各個(gè)部件的重要性

HPLC一般都是由輸液系統(tǒng)(泵) 、進(jìn)樣系統(tǒng) 、 分離系統(tǒng)(柱)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。各部分簡(jiǎn)述如下：

1、輸液系統(tǒng)(高壓泵)及其重要性

高壓泵是關(guān)鍵部件之一，按原理分為兩種類(lèi)型：一類(lèi)是恒流泵，一類(lèi)是恒壓泵。

恒流泵，無(wú)論色譜柱的阻力如何變化、無(wú)論外界有何影響，它輸出的流動(dòng)相的流速可以基本保持不變，這正好是HPLC系統(tǒng)工作的基本要求;而恒壓泵輸出的基本上是恒定不變的壓力，在正常情況下，由于HPLC系統(tǒng)的阻力不會(huì)變化，所以恒壓也可以達(dá)到恒流的效果。但是由于色譜柱、溫度等可能會(huì)有變化，所以可能導(dǎo)致流量變化，這是HPLC使用者不希望看到的結(jié)果。

所以一般來(lái)講，恒流泵比恒壓泵好(橫流泵的使用多于恒壓泵)。目前我國(guó)有近20家企業(yè)在生產(chǎn)各種不同類(lèi)型的HPLC，但是基本上都是采用恒流泵;例如：北京普析公司的L600系列、北京東西電子的LC-5510、 北京瑞利公司的SY-8100 、大連依利特公司的5100、上海伍豐公司的LC100、上海儀電公司的LC210、浙江福立公司的LC1190等等儀器都是采用的高壓恒流泵輸液。

高壓泵的質(zhì)量直接影響整個(gè)HPLC的質(zhì)量，是用戶(hù)關(guān)注的核心部件之一。HPLC高壓泵的重要性及使用者對(duì)高壓泵的具體要求如下：

(1)耐高壓

耐高壓是HPLC系統(tǒng)對(duì)高壓泵的基本要求之一，一般來(lái)講，平均粒徑為4µm左右的填料、內(nèi)徑為5mm左右的色譜柱，當(dāng)流動(dòng)相流速為1-3mL/min時(shí)，要求輸液泵的zui高工作壓力達(dá)到34.47-41.36Mpa(5000-6000psi);目前國(guó)際上商品HPLC泵的zui高工作壓力一般為41.36Mpa (5000psi)左右。但隨著填料粒徑的不斷減小，粒徑為1-2.5µm范圍的小粒徑無(wú)孔色譜填料的應(yīng)用推廣，流動(dòng)相在色譜柱中的阻力會(huì)更大，所以，2004年國(guó)際上出現(xiàn)了超高壓液相色譜，要求輸液泵能夠耐更高的壓力。目前市場(chǎng)上已有達(dá)到68.94Mpa(10000psi)的高壓恒流泵(如：Altex 100A)。

(2)穩(wěn)定性好、脈動(dòng)小

輸液高壓泵的穩(wěn)定性和脈動(dòng)大小會(huì)直接影響HPLC系統(tǒng)的穩(wěn)定性(漂移和重復(fù)性)、影響系統(tǒng)的噪聲、降低靈敏度，特別是HPLC系統(tǒng)采用電化學(xué)檢測(cè)器和示差等檢測(cè)器，或進(jìn)行梯度分離時(shí)更加重要，因此目前國(guó)際上很多高壓泵的壓力脈動(dòng)都可以控制在1%以?xún)?nèi)。

(3) 流量連續(xù)可調(diào)、流量范圍寬

目前國(guó)際上HPLC的高壓泵，大多數(shù)流動(dòng)范圍可以達(dá)到0.001-10.0mL/min(制備色譜的流量更大，有時(shí)要求達(dá)到數(shù)千mL/min)，可以同時(shí)滿(mǎn)足各種不同內(nèi)徑的色譜柱的分析工作要求。

(4) 流量重復(fù)性好

很多HPLC的泵的流量重復(fù)性可以達(dá)到0.07%(RSD)。但是重復(fù)性與測(cè)試方法有關(guān)，目前國(guó)際上一般采用兩種方法測(cè)試：一是重量法，收取泵的單位時(shí)間里的流出液，在天平上直接稱(chēng)其重量，判斷重復(fù)性;二是保留時(shí)間法，根據(jù)保留時(shí)間的長(zhǎng)短，來(lái)判斷流量的重復(fù)性。在HPLC的分析工作中，其定性分析一般是根據(jù)保留時(shí)間。高壓泵的重復(fù)性(RSD)是極其重要的指標(biāo)之一，也是影響HPLC整機(jī)系統(tǒng)重復(fù)性的一項(xiàng)非常重要的性能技術(shù)指標(biāo)。

(5)死體積小

高壓泵的死體積會(huì)影響HPLC的分析精密度和準(zhǔn)確度，特別是影響梯度洗脫的效果，一般總是希望死體積越小越好。因?yàn)楦邏罕玫乃荔w積小，有利于溶劑的快速置換，并且有利于把系統(tǒng)的氣泡及時(shí)排出。

(6) 流量準(zhǔn)確度高

HPLC高壓泵的流量準(zhǔn)確度很重要，直接影響分析測(cè)試數(shù)據(jù)的重復(fù)性(可靠性)。目前國(guó)內(nèi)外HPLC的泵流量重復(fù)性一般在1%左右(與測(cè)試方法有關(guān))，zui好的可達(dá)到0.06%(采用保留時(shí)間法;如美國(guó)waters、日本島津、中國(guó)普析通用的高壓泵等就是如此)。

(7) 具有梯度洗脫功能

目前國(guó)際上的HPLC儀器，一般都具有梯度洗脫功能;因?yàn)?，往往等度洗脫不能解決的分析工作，如果采用梯度洗脫的方法，就可能很好的解決問(wèn)題。因此，HPLC的使用者，往往需要儀器的高壓泵具有流速程序和梯度洗脫程序。

除上述幾點(diǎn)外，對(duì)HPLC的高壓泵的要求還有耐用、流速可控程、具有壓力檢測(cè)保護(hù)功能、維修方便等。雖說(shuō)不是所有的泵都要求具有上述要求，但是很多泵具有這些功能，例如：美國(guó)waters公司的Alliance系列、美國(guó)Agilent公司的1200系列;中國(guó)北京普析通用公司的L600系列、大連的依利特公司的P230系列、上海伍豐公司的LC-100系列和浙江福立公司的LC1190系列高壓泵等，基本上都具有這些功能，一般都能滿(mǎn)足液相色譜分析工作的要求。

2、分離系統(tǒng)(色譜柱)

人們一般所講的分離系統(tǒng)主要指色譜柱及其附件，它是一個(gè)非常重要、非常復(fù)雜的核心部分。一般液相色譜柱的結(jié)構(gòu)如下圖所示，包括柱管(大多采用不銹鋼制作)、填料(后面將詳細(xì)討論)、接頭(一般用不銹鋼制作)、卡套(一般用不銹鋼制作)、壓帽、密封環(huán)、濾片、螺絲(一般用不銹鋼制作)、連接管道(一般用不銹鋼制作)等等。

HPLC的色譜柱主體組成(結(jié)構(gòu))如下：

1)色譜柱結(jié)構(gòu)：色譜柱主體組成一般如下：

1-色譜柱的塑料保護(hù)頭；2-柱頭螺絲；3-刃環(huán)；4-密封環(huán)；5-濾片(篩板)；6-柱體(不銹鋼管)；7-色譜柱填料。

色譜柱的篩板(過(guò)濾板)一般是用不銹鋼或鈦合金材料制作，其孔徑一般在0.2-20μm之間，孔徑大小主要取決于柱填料的粒度，它是一個(gè)非常重要的零件，它可以防止填料漏出。同時(shí)，防止色譜柱工作時(shí)雜質(zhì)進(jìn)入柱內(nèi)引起分離效果下降，甚至容易引起色譜柱堵塞等等。色譜柱與輸液管連接處一般需要使用不銹鋼制作的卡套和不銹鋼制作的固緊接頭螺釘，它們也非常重要，否則色譜柱系統(tǒng)會(huì)漏液，結(jié)果使柱壓下降、流動(dòng)相或樣品漏出，嚴(yán)重影響分析測(cè)試結(jié)果，甚至不能進(jìn)行分析測(cè)試工作。

2)色譜柱分類(lèi)：

從類(lèi)型上來(lái)說(shuō)，色譜柱可以分為制備型和分析型兩大類(lèi)，一般分析型的柱使用zui多。如果細(xì)分，色譜柱又可以分為常規(guī)柱、窄徑柱、毛細(xì)管柱、制備柱和半制備柱等等。為提高分析速度，有人經(jīng)常使用短柱，其柱長(zhǎng)5-10cm，填料粒徑多為3μm左右。很多分析工作者比較強(qiáng)調(diào)分析靈敏度，因此發(fā)展了窄徑柱、毛細(xì)管柱和微徑柱。這些柱子的優(yōu)點(diǎn)是：所需樣品少、所需流動(dòng)相少、靈敏度高、容易控制溫度。但是它們對(duì)檢測(cè)器的流動(dòng)池、柱外的管道、接頭、進(jìn)樣閥等要求大大提高了。

色譜柱的柱效是zui重要的關(guān)鍵指標(biāo)，一般都取決于固定相的性能和裝柱技術(shù)。一般HPLC的色譜柱固定相(填料)大致有三種：硅膠或以硅膠為基質(zhì)的填料、聚合物填料和無(wú)機(jī)物填料。正相色譜柱大多采用硅膠類(lèi)填料，反相色譜柱則多以硅膠為基質(zhì)組成的官能團(tuán)類(lèi)的填料。以聚合物為填料的色譜柱zui大的特點(diǎn)是PH值可在1-14之間都能用，疏水性強(qiáng)。但無(wú)機(jī)填料色譜柱一般只是限于特殊用途，比較少用。

因?yàn)镠PLC的樣品都為溶液，而溶液受溫度影響很大，例如：溫度對(duì)溶劑的溶解能力、色譜柱的柱效、流動(dòng)相的粘度都會(huì)產(chǎn)生影響。如果溫度升高，可能會(huì)提高溶液在流動(dòng)相中的溶解度，可以降低分配系數(shù)K;降低流動(dòng)相粘度可以降低柱壓，有利于保護(hù)色譜柱，延長(zhǎng)色譜柱的壽命。但是，溫度不能太高，否則會(huì)產(chǎn)生氣泡。

HPLC工作者還必須注意不同的溫度，對(duì)色譜柱的保留時(shí)間、分離效果，及檢測(cè)器的靈敏度都會(huì)有影響，特別是對(duì)示差折光器的靈敏度、zui小檢出限的影響很大。所以，很多HPLC特別注意對(duì)恒溫系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，這些都是HPLC設(shè)計(jì)者、使用者應(yīng)該重視的問(wèn)題。

實(shí)踐證明：色譜柱的技術(shù)含量很高，它除了與色譜柱的結(jié)構(gòu)有關(guān)外，更加重要的還有：既與固定相的性能有關(guān)，又與裝柱時(shí)的填充料和填充技術(shù)有關(guān)。有些使用者根據(jù)使用要求自己裝色譜柱，大多數(shù)使用者都是使用已經(jīng)裝好的商品色譜柱。不管是哪種柱，在使用前一定要對(duì)色譜柱進(jìn)行認(rèn)真的考察;使用期間或放置一段時(shí)間后，也要重新檢查、測(cè)試。這個(gè)問(wèn)題目前國(guó)內(nèi)很多HPLC使用者很不了解或很不重視;他們以為買(mǎi)來(lái)的色譜柱，一定就是合格的、好用的色譜柱，并不知道它還有與系統(tǒng)是否相匹配的問(wèn)題;不知道它會(huì)對(duì)前面的高壓泵、后面的檢測(cè)器有什么影響等等。所以在使用過(guò)程中，總是磕磕碰碰，不能得到zui佳的分析結(jié)果。

HPLC的色譜柱(分離柱)是極其重要的部件之一，根據(jù)填料的不同一般可分為：反相柱、正相柱、其它柱三類(lèi)，分別簡(jiǎn)述如下。

(1)反相色譜柱：它是使用zui多的一種色譜柱;一般約占75%左右; 其中，C18柱約占 65%;C8柱占15%左右;苯基柱<5%。反相色譜是目前應(yīng)用得zui為廣泛的一種高效液相色譜方法。C18 在反相色譜中應(yīng)用得zui為廣泛，大概超過(guò)一半以上。

(2)正相色譜柱：正相色譜柱也經(jīng)常被使用，約占20%左右。

(3)其它色譜柱 (手性柱, 離子交換柱): 約占10%左右。

要用好、保護(hù)好色譜柱，是一個(gè)需要特別重視的問(wèn)題，如果稍有不慎，就有可能降低色譜柱的柱效、縮短色譜柱的壽命，甚至損壞色譜柱。

3、檢測(cè)系統(tǒng)

檢測(cè)器種類(lèi)很多也非常重要，但是使用zui多的是光學(xué)類(lèi)檢測(cè)器，占比約75%左右，這里重點(diǎn)光學(xué)類(lèi)檢測(cè)器。

1)光學(xué)類(lèi)檢測(cè)器基本功能：提供準(zhǔn)確的波長(zhǎng)、提供足夠小的檢測(cè)限(靈敏度，這是用戶(hù)zui關(guān)心的問(wèn)題之一)、提供小的噪聲、飄移和重復(fù)性，給出zui終檢測(cè)結(jié)果。

2)zui常用HPLC檢測(cè)器的類(lèi)型

在國(guó)內(nèi)外的科技界，很多色譜工作者認(rèn)為高壓泵和色譜柱是HPLC的核心，檢測(cè)器只是一種光譜儀器，沒(méi)有分離就不成為色譜。所以，通常認(rèn)為高壓泵和色譜柱zui重要。而光譜工作者認(rèn)為光譜儀器是HPLC的核心，沒(méi)有它，分析檢測(cè)結(jié)果什么也不知道，高壓泵只是輸液、色譜柱只是分離，關(guān)鍵要靠檢測(cè)器檢測(cè)才有測(cè)試結(jié)果，所以檢測(cè)器zui重要。作者認(rèn)為上述兩種說(shuō)法都不完全正確，應(yīng)該說(shuō)HPLC系統(tǒng)中每個(gè)部分都重要，千萬(wàn)不能偏看哪個(gè)部分，否則將得不到可靠的分析檢測(cè)數(shù)據(jù)。

目前，國(guó)內(nèi)外科技工作者zui常用的檢測(cè)器有以下幾種：蒸發(fā)光檢測(cè)器、分子熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、各類(lèi)紫外可見(jiàn)光譜檢測(cè)器、各類(lèi)質(zhì)譜檢測(cè)器、各類(lèi)AAS(原子吸收光譜)檢測(cè)器、各類(lèi)原子熒光檢測(cè)器等等。在各類(lèi)聯(lián)用技術(shù)中，凡與HPLC的泵、柱聯(lián)用的儀器，都可以稱(chēng)之為檢測(cè)器。

3)光學(xué)類(lèi)檢測(cè)器的主要技術(shù)指標(biāo)：

光學(xué)類(lèi)檢測(cè)器是所有檢測(cè)器中使用zui多的一種，它的主要技術(shù)指標(biāo)如下：

(1)波長(zhǎng)范圍：長(zhǎng)波和短波兩端決定儀器的適用范圍，限制或決定儀器的適用性。例如：一般只有氘燈的紫外檢測(cè)器，就不能測(cè)試吸收峰在618nm的強(qiáng)致癌物質(zhì)孔雀石綠，以及吸收峰在200nm的紫外吸收物質(zhì)，因?yàn)殡疅魶](méi)有618nm這根譜線(xiàn)，而在200nm時(shí)能量弱、信噪比差。

(2)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：影響摩爾吸光系數(shù)、影響儀器的靈敏度，比較儀器時(shí)很重要。

(3)波長(zhǎng)重復(fù)性：影響分析數(shù)據(jù)的重復(fù)性。

(4)光譜帶寬：大家不大注意，它是分析誤差來(lái)源之一，一般采用譜線(xiàn)輪轂法測(cè)試。

(5)噪聲：非常重要，一般光譜儀器有多大的噪聲，就可能在測(cè)試結(jié)果中增加多大的誤差。

有些儀器采用軟件平滑噪聲，作者認(rèn)為不是好辦法。因?yàn)槠交瑫r(shí)一是信號(hào)也損失了一部分，二是硬件的噪聲并沒(méi)有去掉。測(cè)試結(jié)果表面上噪聲小了，其實(shí)信噪比沒(méi)有變化。所以，作者認(rèn)為應(yīng)該從算法上著手，采用目前國(guó)際上一種zui先進(jìn)的利用軟件、算法降噪技術(shù)，這種技術(shù)只降噪聲，不影響信號(hào)，這是光譜儀器研發(fā)工作者應(yīng)該重視的問(wèn)題。

(6)穩(wěn)定性(含漂移、重復(fù)性)：它直接限制光譜儀器的可靠性。

(7)光度范圍：應(yīng)該注意多少濃度范圍內(nèi)能給出準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

(8)量程：應(yīng)重視zui靈敏量程，不能用zui大量程測(cè)試儀器的靈敏度(后面將有論述)。

4) 幾種特別值得重視的HPLC檢測(cè)器

(1)zui常用的：紫外檢測(cè)器(UVD)(占70%左右)、熒光檢測(cè)器(FLD)(占10%) 、視差折光檢測(cè)器(RID )(占3%)、其他檢測(cè)器(如質(zhì)譜等等，占17%)。

(2)還有目前使用非常多的、質(zhì)量型檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器--ELSD， (已上藥典，可以替代RID)。

(3)用戶(hù)目前特別關(guān)注的新型檢測(cè)器：質(zhì)譜檢測(cè)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、放射性檢測(cè)器、光電導(dǎo)檢測(cè)器、旋光檢測(cè)器、電噴霧檢測(cè)器(zui新的質(zhì)量檢測(cè)器，后面還將詳細(xì)討論)等等。

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HPLC關(guān)鍵性能技術(shù)指標(biāo)的測(cè)試

1、靈敏度的測(cè)試方法

HPLC的靈敏度可定義為：一、定量的物質(zhì)，通過(guò)HPLC的檢測(cè)器時(shí)，儀器所給出的信號(hào)大小就叫做該HPLC的靈敏度，有時(shí)也稱(chēng)為響應(yīng)值。對(duì)使用者來(lái)講，總是希望HPLC儀器有較高的靈敏度，因?yàn)殪`敏度高，就意味著對(duì)等量的同一樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，儀器有較大的輸出信號(hào)。但是，靈敏度的高低，并不能表示HPLC儀器的檢測(cè)能力。只有檢出限，才能表示儀器的zui大檢測(cè)能力。

HPLC靈敏度的測(cè)試方法：主要根據(jù)信噪比的定義進(jìn)行測(cè)試。一般取信號(hào)等于或大于噪聲2倍時(shí)的檢測(cè)量或濃度(信號(hào)強(qiáng)度)作為HPLC的信號(hào)大小。信號(hào)與噪聲二者相除即為儀器的信噪比(靈敏度，但是要求S/N≧2)。

2、檢測(cè)限測(cè)試方法

講HPLC的指標(biāo)、給出HPLC的譜圖，應(yīng)該實(shí)事求是的給出使用的靈敏度量程(一般使用zui靈敏量程)，給出樣品濃度(一般是噪聲的3倍左右)，才能說(shuō)明儀器的檢測(cè)限或靈敏度。

3、光學(xué)類(lèi)檢測(cè)器噪聲的測(cè)試方法

HPLC的噪聲是一種與被測(cè)樣品無(wú)關(guān)的、隨機(jī)輸出的信號(hào)。國(guó)際上對(duì)噪聲的定義、測(cè)試方法各異。例如：美國(guó)材料協(xié)會(huì)制訂的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)(ASTM)，規(guī)定噪聲分為長(zhǎng)噪聲、短噪聲、和超短噪聲三種。長(zhǎng)噪聲是指每小時(shí)內(nèi)有6個(gè)至60個(gè)變化周期的噪聲，所以，測(cè)定時(shí)間至少應(yīng)該測(cè)試一小時(shí);短噪聲是指每小時(shí)內(nèi)有1個(gè)至10個(gè)變化周期的噪聲，所以，測(cè)定時(shí)間至少應(yīng)該測(cè)試10分鐘至60分鐘內(nèi);超短噪聲是指每分鐘內(nèi)有10個(gè)以上的變化周期的噪聲，所以，測(cè)定時(shí)間應(yīng)該大于1分鐘。

從使用者的角度看，噪聲又分為靜態(tài)噪聲和動(dòng)態(tài)噪聲。其測(cè)試方法如下：

1)靜態(tài)噪聲測(cè)試：冷態(tài)開(kāi)機(jī)(關(guān)機(jī)2小時(shí)后開(kāi)機(jī))，預(yù)熱30分鐘，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)。在這1小時(shí)里，任取10分鐘(包含zui差的峰-峰值)，在這10分鐘里取峰對(duì)峰值(P-T0-P)的zui大值，就是儀器的噪聲。但是，10分鐘里的峰對(duì)峰(P-T0-P)值，不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值，即：“10分鐘里的峰對(duì)峰”值，不等于瞬時(shí)的峰-峰(P-P)值，測(cè)試數(shù)據(jù)前面應(yīng)加“±”符號(hào)。

注意：開(kāi)機(jī)30分鐘后，儀器調(diào)整到zui靈敏度檔(如：對(duì)量程為0.005-3.0AUFS的儀器，取0.005AUFS，即縱坐標(biāo)設(shè)置為0.005A);設(shè)置波長(zhǎng)λ=250nm(有人設(shè)置500 nm，但zui好測(cè)試250 nm);設(shè)置0 Abs(即時(shí)間掃描，吸光度從0點(diǎn)開(kāi)始測(cè)試);光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不需選擇)。

在上述條件下，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)(用儀器上的CRT指示輸出，或用數(shù)字電壓表監(jiān)測(cè))。在1小時(shí)內(nèi)，任取10分鐘的峰對(duì)峰值(P-T0-P)，其zui大者前面加“±”符號(hào)，即是儀器的噪聲。目前，國(guó)際上大多數(shù)科技工作者，基本上采用這種方法測(cè)試HPLC儀器的靜態(tài)噪聲。

有些科技工作者，認(rèn)為在10分鐘的峰對(duì)峰值(P-T0-P)前如果要加“±”符號(hào)，就應(yīng)對(duì)峰-峰值的絕對(duì)值先除“2”。這種做法是不妥的，會(huì)低估儀器的噪聲。因?yàn)樵肼暿请S機(jī)的，可能是“+”值也可以是“-”值。

上述儀器條件的設(shè)置，在有些儀器上是不需要的，因?yàn)橛捎谟?jì)算機(jī)的發(fā)展和普遍應(yīng)用，很多儀器的坐標(biāo)設(shè)置，完全由儀器的計(jì)算機(jī)自動(dòng)設(shè)置。

2)動(dòng)態(tài)噪聲測(cè)試：

作者在研發(fā)檢測(cè)器和使用HPLC時(shí)所采用的測(cè)試動(dòng)態(tài)噪聲方法如下：連接恒流泵、液相色譜分離柱和檢測(cè)器。在恒流泵和檢測(cè)器中有移動(dòng)相(流動(dòng)相)流動(dòng)。

具體操作方法如下：

冷態(tài)開(kāi)機(jī)，預(yù)熱30分鐘，設(shè)恒流泵的流速1mL/min;檢測(cè)器設(shè)置：儀器調(diào)整到zui靈敏度檔(如：0.005AUFS;即縱坐標(biāo)設(shè)置為0.005AU);波長(zhǎng)λ=250nm(有人設(shè)置500 nm，但zui好測(cè)試250 nm)、0 Abs(即時(shí)間掃描，吸光度和時(shí)間都從0點(diǎn)開(kāi)始測(cè)試)，光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不能選擇)，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)，可以用儀器上的CRT指示噪聲在這1小時(shí)里，任取10分鐘(包含zui差的峰-峰值)，在這10分鐘里取峰對(duì)峰值(P-T0-P)的zui大值，就是儀器的噪聲。但是，10分鐘里的峰對(duì)峰(P-T0-P)值，不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值，即：“10分鐘里的峰對(duì)峰”值，不等于瞬時(shí)的峰-峰(P-P)值。測(cè)試數(shù)據(jù)前面應(yīng)加“±”符號(hào)。目前，國(guó)際上基本上采用這種方法測(cè)試HPLC儀器的動(dòng)態(tài)噪聲。有時(shí)候，為了節(jié)省時(shí)間，也可以在漂移測(cè)試的基礎(chǔ)上檢測(cè)噪聲。但是開(kāi)機(jī)時(shí)間就不是30分鐘，而是2小時(shí)。這樣所得測(cè)試數(shù)據(jù)稍小于開(kāi)機(jī)30分鐘的數(shù)據(jù)(因此，給出數(shù)據(jù)時(shí)要說(shuō)明方法)，數(shù)據(jù)處理方法仍如上所述。

3)目前國(guó)內(nèi)外的HPLC制造商，往往在儀器樣本上給出的都是檢測(cè)器的靜態(tài)噪聲，同時(shí)注明了儀器的狀態(tài)(檢測(cè)器空池)。這樣做，對(duì)于使用者了解整個(gè)儀器系統(tǒng)中的檢測(cè)器性能有利，也是可以的。但是不符合使用者的總體要求，因?yàn)槭褂谜叩目傮w要求是：整個(gè)HPLC系統(tǒng)(包括泵、柱、檢測(cè)器)處在使用狀態(tài)(動(dòng)態(tài))的情況下，整機(jī)的噪聲有多大。所以，作者認(rèn)為靜態(tài)噪聲可以給出，也可以不給出，但是動(dòng)態(tài)噪聲必須給出。

注意：噪聲測(cè)試時(shí)，國(guó)際接軌的做法是在500nm。但是有些廠(chǎng)商卻給出700nm處測(cè)試的噪聲，這也是不對(duì)的。因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)短，能量大;500nm處的能量比700nm處大，所以在700nm處測(cè)試的噪聲，數(shù)據(jù)會(huì)偏小，數(shù)據(jù)不真實(shí)。

4)中國(guó)的HPLC國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(2011版)和計(jì)量檢定規(guī)程JJG705-2002也規(guī)定了噪聲的測(cè)試方法，但是分別都還有一些值得推敲的問(wèn)題，請(qǐng)大家自己參閱。

5)這里特別需要提出的是：目前有些國(guó)外HPLC生產(chǎn)廠(chǎng)商，為了吸引用戶(hù)，制造了一些違背儀器學(xué)理論的指標(biāo)。例如：國(guó)外某廠(chǎng)商，在招標(biāo)中給出HPLC的噪聲時(shí)，先采用計(jì)算機(jī)對(duì)噪聲進(jìn)行平滑，并且采用zui大量程測(cè)試，結(jié)果給出的HPLC噪聲非常小、譜圖基線(xiàn)非常平直、譜峰尖而陡直，給人的印象是世界yi流的HPLC。其實(shí)不然，給出的數(shù)據(jù)和譜圖都是虛假的。如果用盲樣進(jìn)行比對(duì)測(cè)試，因?yàn)樗麄兊腍PLC的噪聲大，信噪比差，靈敏度差，所以立即敗下陣來(lái)。

我國(guó)三聚氰胺國(guó)標(biāo)的建立過(guò)程中的比對(duì)測(cè)試結(jié)果就是如此，專(zhuān)家們從三家公司(兩家外企,一家國(guó)產(chǎn)儀器公司(普析通用公司))的三種HPLC全方位比對(duì)測(cè)試的結(jié)果(標(biāo)樣由國(guó)家標(biāo)物中心提供)中，zui后選用了國(guó)產(chǎn)北京普析通用的早期HPLC產(chǎn)品L6作為國(guó)家建標(biāo)的儀器(L6是《原料乳三聚氰胺快速測(cè)定--液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用的weiyi國(guó)產(chǎn)儀器)，其根本原因是L6的比對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠、噪聲小、S/N高、性?xún)r(jià)比高等等。

4、穩(wěn)定性(基線(xiàn)漂移和重復(fù)性)測(cè)試方法：

這里包括儀器的靜態(tài)基線(xiàn)漂移和動(dòng)態(tài)基線(xiàn)漂移的測(cè)試方法：

一般來(lái)說(shuō)，使用者不關(guān)心單個(gè)檢測(cè)器的靜態(tài)指標(biāo)，所以，可以不專(zhuān)門(mén)測(cè)試檢測(cè)器的靜態(tài)基線(xiàn)漂移。但是，作者認(rèn)為設(shè)計(jì)、制造者應(yīng)該測(cè)試靜態(tài)基線(xiàn)漂移這個(gè)指標(biāo)，測(cè)試方法與測(cè)試整機(jī)(系統(tǒng))的動(dòng)態(tài)基線(xiàn)漂移完全相同。

動(dòng)態(tài)基線(xiàn)漂移測(cè)試方法如下：冷態(tài)開(kāi)機(jī)，預(yù)熱2小時(shí)，連續(xù)測(cè)試1小時(shí)。1小時(shí)內(nèi)的zui大zui小值之差就是動(dòng)態(tài)漂移。(也有測(cè)試更長(zhǎng)時(shí)間的，例如作者在FLD檢測(cè)器研發(fā)時(shí)，為了考察儀器的長(zhǎng)時(shí)間漂移，連續(xù)測(cè)試48小時(shí)，儀器的漂移小于5mV)。

5、重復(fù)性及其測(cè)試方法：

與漂移測(cè)試方法相同，對(duì)儀器進(jìn)行多次測(cè)試(作者認(rèn)為一般是5-7次)，其數(shù)據(jù)的符合程度就是重復(fù)性，一般用RSD表示。

6、量程范圍及其測(cè)試方法

1)定義

儀器能適用測(cè)量的范圍或儀器能滿(mǎn)足測(cè)量要求的范圍叫量程范圍。其表示方法為AUFS(Absorbance Unit Full Scale)或AU/FS(Absorbance Unit/Full Scale)。80年代以前，也有很多人用OD(光密度)這個(gè)概念表示Abs(Absorbance)，即用ODFS來(lái)表示UVD的量程，但是OD不符合光對(duì)物質(zhì)吸收的物理概念，不符合儀器學(xué)理論，所以，目前國(guó)際上已經(jīng)廢除“OD”概念，不能再使用“ODFS”了。

在實(shí)際的日常分析工作中，也有化學(xué)工作者用具體的化學(xué)物質(zhì)來(lái)描述HPLC的量程。但是不同物質(zhì)，由于摩爾吸光系數(shù)不同，表現(xiàn)出的靈敏度也不同，所以作者認(rèn)為用具體的化學(xué)物質(zhì)來(lái)描述HPLC的量程不符合儀器學(xué)理論的要求。作者認(rèn)為，給出AUFSzui合適，其zui大優(yōu)點(diǎn)是這種表示方法與樣品的性質(zhì)無(wú)關(guān)，便于比較同一類(lèi)型檢測(cè)器的性能優(yōu)劣。但是這種表示方法對(duì)使用者來(lái)說(shuō)不大直觀(guān)、不大方便。目前，國(guó)際上的HPLC儀器的量程范圍一般為：0.005-2.5AUFS(例如Waters的HPLC)。少數(shù)優(yōu)質(zhì)儀器的下限為0.001AUFS,但是有些儀器給出0.001-3.0AUFS的量程是有水分的，因?yàn)閁VD的雜散光一般都比較大，而雜散光是光吸收類(lèi)分析儀器主要分析誤差的來(lái)源，它主要限制被分析樣品濃度(吸光度)的上限。所以，HPLC的UVD給出0.001-3.0AUFS的量程一般是不準(zhǔn)確的。

目前，國(guó)內(nèi)外很多HPLC儀器的UVD生產(chǎn)廠(chǎng)商不給儀器的量程，這是不妥的。因?yàn)?，不給量程范圍就意味著不知道檢測(cè)器的靈敏度(下限)，不知道多少吸光度時(shí)儀器能達(dá)到滿(mǎn)度。當(dāng)然，目前有很多HPLC儀器的UVD生產(chǎn)廠(chǎng)商，給出了儀器對(duì)某一物質(zhì)的zui小檢測(cè)濃度或zui小檢測(cè)量，這在某種程度上也可以反映儀器的靈敏度，并且對(duì)使用者來(lái)說(shuō)，比較方便、比較直觀(guān)。但是，這種表示方法只是對(duì)某一物質(zhì)而言，特別是會(huì)帶來(lái)樣品處理產(chǎn)生的誤差、容易低估儀器噪聲的影響，因此，從儀器學(xué)理論的角度來(lái)看是不科學(xué)的。

2)量程范圍測(cè)試方法

目前，國(guó)際上對(duì)HPLC的UVD的量程范圍設(shè)計(jì)指標(biāo)，一般在0.005-3.0AUFS內(nèi)。作者在研制HPLC的UVD檢測(cè)器時(shí)，用原上海大華儀表廠(chǎng)生產(chǎn)的XWT-204記錄儀的1V檔測(cè)試。當(dāng)對(duì)數(shù)放大器的差分放大器的總輸出為1V時(shí)，記錄儀滿(mǎn)度(100格)。當(dāng)儀器的有效光電信號(hào)從0.005-3.0V時(shí)，均可保證對(duì)數(shù)放大器的輸出為1V;此時(shí)，這個(gè)0.005-3.0V對(duì)應(yīng)的吸光度為0.005-3.0Abs。要求從0.005-3.0Abs時(shí)，光度準(zhǔn)確度都能保證在1%以?xún)?nèi)(即1V±10mv)。如此測(cè)量3次并取均值，即是HPLC的量程范圍(0.005-3.AUFS)。

目前，國(guó)內(nèi)外許多制造商都用萘或者蒽來(lái)測(cè)試HPLC系統(tǒng)的靈敏度，這種做法也可以，但是從儀器學(xué)理論角度考量，作者認(rèn)為不科學(xué)。因?yàn)椋?/span>①、不能給出儀器的測(cè)量范圍，只能給出萘的zui小檢測(cè)濃度;②、試樣的配制會(huì)帶來(lái)很多誤差;③、這種方法所作的測(cè)試，實(shí)際上是計(jì)算出來(lái)的靈敏度，而不是測(cè)試出來(lái)的真正的靈敏度，不能反應(yīng)儀器真正的靈敏度。如果實(shí)際測(cè)試，肯定比計(jì)算的數(shù)據(jù)大很多。④、不與國(guó)際接軌，不便比較不同儀器的性能。雖說(shuō)近幾年國(guó)內(nèi)外采用此方法的科技工作者比過(guò)去多，但是不能掩蓋方法的局限性。所以，zui好的方法還是給出儀器的測(cè)量范圍。

還有人用靜態(tài)噪聲的2倍或3倍來(lái)計(jì)算zui小檢測(cè)濃度，這樣計(jì)算出來(lái)的結(jié)果，同樣是不真實(shí)的。因?yàn)閺膬x器學(xué)理論角度來(lái)看，一般在正常情況下，zui小檢測(cè)濃度是在系統(tǒng)處在動(dòng)態(tài)的情況下測(cè)試的，所以計(jì)算zui小檢測(cè)濃度就必須用動(dòng)態(tài)噪聲，而不能用靜態(tài)噪聲。

還有人測(cè)試HPLC的zui小檢測(cè)濃度時(shí)，采用一些計(jì)算公式(如：Cmin=2NC/H×20，式中：Cmin 為zui小檢測(cè)濃度，N為儀器的噪聲;C為濃度，H為峰高)，計(jì)算時(shí)不考慮移動(dòng)相的流速，這是不妥的。不考慮移動(dòng)相的流速或計(jì)算公式中去掉移動(dòng)相的流速，就意味著是靜態(tài)的zui小檢測(cè)濃度，而使用者需要的是系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)zui小檢測(cè)濃度。所以作者認(rèn)為這種計(jì)算方法很不合理，對(duì)使用者來(lái)講是沒(méi)有意義的，這種計(jì)算方法不可采用。

4

HPLC儀器的zui新進(jìn)展

1

二維及多維液相色譜儀的發(fā)展：美國(guó)EKSIGENT公司和日本KYA TECH公司生產(chǎn)的納升級(jí)二維高效液相色譜儀，其組合了納米微柱和二維液相色譜技術(shù)，可直接用于蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)研究工作中。　　

2

毛細(xì)管和納升高壓液相色譜儀的發(fā)展，美國(guó)DIONEX公司生產(chǎn)Ulti Mate毛細(xì)管和納升高效液相色譜儀，可進(jìn)行微柱、毛細(xì)管柱和納升柱三種微柱液相色譜分析。　　

3

超高壓液相色譜儀(UPLC)自從2004年WATERS公司推出ACQUITY UPLC后，JASCO、AGILENT、THERMO-FISHER SCIENTIFIC、SHIMADZU、DIONEX、HITACHI、上海通微等都先后推出了各自的超高效液相色譜議。　　

4

新型的電噴霧檢測(cè)器的問(wèn)世，它是zui新的質(zhì)量檢測(cè)器之一，其工作原理如下：

淋洗液從HPLC柱子進(jìn)入 Corona (1) →在氣腔中被氮?dú)饣蚩諝忪F化 (2) →小液滴進(jìn)入干燥管 (3) →大液滴進(jìn)入廢液管 (4) →干燥的顆粒進(jìn)入混合腔(5) →另一路氣流經(jīng)過(guò)帶電Corona體(6) →帶電氣體和干燥的顆?；旌鲜诡w粒帶電 (7) →離子阱把多余的電荷去除(8) →帶電顆粒進(jìn)入采集器，電荷被高靈敏度靜電計(jì)測(cè)量(9)→信號(hào)傳輸?shù)缴V數(shù)據(jù)軟件(10)

5

新型的HPLC儀器不斷問(wèn)世

目前，HPLC儀器面臨三大挑戰(zhàn)：高速度、高靈敏度、高分離效率。所以，近幾年各國(guó)科技工作者都很重視對(duì)HPLC儀器的研發(fā)。近幾年，我國(guó)的有關(guān)生產(chǎn)廠(chǎng)商在這方面取得了令人矚目的成就，例如：

1)浙江福立分析儀器股份有限公司，從HPLC的色譜柱填料這個(gè)核心部件入手，研發(fā)成功了優(yōu)質(zhì)的、新型的LC5190超高效液相色譜儀(UPLC)。

很多UPLC采用2微米填料的分離柱，柱效比常規(guī)HPLC提高了3倍，柱壓上升了9倍。但是，因?yàn)樯V柱縱向溫度梯度分布改變，導(dǎo)致色譜峰增寬、分離效率下降，有時(shí)還會(huì)引起出峰順序的變化。浙江福立分析儀器股份有限公司突破了一系列關(guān)鍵技術(shù)、采用了多種zhuanli技術(shù)：他們采用3微米的新型核殼型分離填料色譜柱，使系統(tǒng)壓力降低到常規(guī)HPLC范圍，解決了2微米分析柱的不足，保證了UPLC超高效的分離分析結(jié)果的同時(shí)，降低了柱壓，研發(fā)成功了全新的LC5190超高效液相色譜儀。該儀器的理論塔板數(shù)與采用2微米的全多孔型柱效相同，但是壓力只有其1/2左右。特別是儀器的性?xún)r(jià)比、長(zhǎng)期穩(wěn)定性、可靠性等都提高了，維修也更加簡(jiǎn)便了。該儀器的高精度輸液系統(tǒng)、低殘留進(jìn)樣系統(tǒng)、精準(zhǔn)的溫控柱溫箱和高靈敏度紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等保證了儀器的先進(jìn)性、可靠性。儀器具有智能化工作站系統(tǒng)，可以全面滿(mǎn)足用戶(hù)的各種應(yīng)用需求，符合GMP/GLP要求。

2)上海伍豐公司推出了EX1700s-HPLC超快速高效液相色譜儀

該儀器為國(guó)內(nèi)zui早推向市場(chǎng)的超快速高效液相色譜儀，與常規(guī)HPLC相比，分離能力強(qiáng)，出峰對(duì)稱(chēng)性更好，基線(xiàn)更穩(wěn)定，分辨率更高，分析時(shí)間大大縮短，降低了客戶(hù)成本。

該儀器的輸液系統(tǒng)zui大輸出壓力：80MPa，流量范圍：0.001-5.000mL/min;流量設(shè)定值誤差：Ss≤± 1%(水，20℃, 1mL/min，10MPa); Ss≤±2%(水，20℃, 1mL/min，40MPa)。流量穩(wěn)定性誤差：SR≤ 0.3%(1mL/min)(10MPa)。

3)上海伍豐推出了第三代LC-100液相色譜儀

第三代LC-100可選擇分析型系統(tǒng)、半制備型系統(tǒng)、制備型系統(tǒng)。新增全新溶劑管理器，可實(shí)現(xiàn)在二元梯度系統(tǒng)基礎(chǔ)上輕松切換至4-8種溶劑，并可選配脫氣單元及柱溫箱，大大提升用戶(hù)體驗(yàn)。可選擇手動(dòng)進(jìn)樣或自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，數(shù)據(jù)工作站分析軟件可根據(jù)客戶(hù)需求提供兩個(gè)版本的選擇，符合GMP、FDA、3Q等認(rèn)證需求。

4)上海通微公司的高效微流電色譜儀和定量毛細(xì)管電泳儀問(wèn)世

高效微流電色譜儀為國(guó)家科技部“十二五”重大攻關(guān)項(xiàng)目，是國(guó)際shou創(chuàng)的一種新型HPLC儀器;在柱效、分離速度等很多方面都優(yōu)于UPLC，其柱效比UPLC高10倍、5秒鐘可以分離5個(gè)芳香烴(一般HPLC需要10-20秒)。該儀器總體優(yōu)于UPLC，又是一個(gè)國(guó)際shou創(chuàng)。定量毛細(xì)管電泳儀也是國(guó)際shou創(chuàng)(一般毛細(xì)管電泳儀，定量分析精度很差)。

HPLC儀器的進(jìn)展發(fā)展很快，遠(yuǎn)不止如上所述。因篇幅所限，此不贅述。

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幾個(gè)有關(guān)問(wèn)題

1、分析儀器和儀器分析工作者應(yīng)該“不忘各自的初心，牢記各自的使命”。分析儀器制造者的初心是什么?應(yīng)該是為用戶(hù)服務(wù)，做出的儀器質(zhì)量好，穩(wěn)定可靠，能滿(mǎn)足使用者的使用要求。分析儀器工作者的使命是什么?應(yīng)該是做出的儀器好用，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。所以，分析儀器制造商應(yīng)該盡量到用戶(hù)中去，認(rèn)真去了解用戶(hù)的需求，儀器制造商必須將儀器專(zhuān)業(yè)技術(shù)與儀器應(yīng)用技術(shù)緊密結(jié)合，這樣，儀器制造商才能作出優(yōu)質(zhì)儀器、才能提供可靠性好的儀器，才能保證儀器使用者得到zui佳分析檢測(cè)結(jié)果。

儀器使用者的初心是什么?應(yīng)該是得到zui佳分析測(cè)試數(shù)據(jù)。儀器使用者的使命是什么?就是用好儀器，認(rèn)真學(xué)習(xí)或搞清楚儀器的性能指標(biāo)的物理意義、對(duì)分析誤差的影響，認(rèn)真選擇儀器條件、認(rèn)真做好樣品前處理，努力將儀器用在zui佳條件下。這樣，才能得到zui佳分析檢測(cè)數(shù)據(jù)，才能得到分析誤差zui小的分析檢測(cè)結(jié)果。

我國(guó)目前的現(xiàn)狀是：做儀器的人，不知道使用者在如何使用儀器，不知道使用者對(duì)儀器的具體要求，所以，做出的儀器就不大好用或者不好用，這是制造者與使用者脫節(jié)的原因。而使用者不知道制造者在如何制造儀器，不知道儀器的性能指標(biāo)的物理意義、對(duì)分析誤差的影響，所以，買(mǎi)儀器時(shí)要求指標(biāo)越高越好，結(jié)果根本用不上。實(shí)驗(yàn)室里儀器堆得滿(mǎn)滿(mǎn)的，但是很多儀器用不上，造成大大的浪費(fèi)。

所以，不忘初心，牢記使命，制造儀器和使用儀器的科技工作者緊密結(jié)合非常重要。

2、沒(méi)有理論指導(dǎo)的儀器研發(fā)和生產(chǎn)工作都是閉著眼睛抓麻雀，一定要重視儀器學(xué)理論;

從事HPLC儀器研發(fā)和使用的科技工作者，只有重視儀器學(xué)理論才能做好HPLC儀器、才能用好HPLC儀器。儀器學(xué)理論是一把金鑰匙，一通百通，它可以使你做出穩(wěn)定可靠的優(yōu)質(zhì)HPLC儀器，使你在使用HPLC儀器時(shí)，能夠調(diào)整好zui佳儀器條件、保證得到準(zhǔn)確可靠的分析檢測(cè)數(shù)據(jù)。

目前我國(guó)的20多家HPLC儀器生產(chǎn)商和廣大HPLC用戶(hù)，對(duì)儀器學(xué)理論重視不夠，基本上不了解HPLC各項(xiàng)性能指標(biāo)的物理意義和它們對(duì)分析誤差的影響，特別是不懂得HPLC儀器的各項(xiàng)指標(biāo)如何影響分析檢測(cè)數(shù)據(jù)的誤差。這是中國(guó)分析儀器及其應(yīng)用落后國(guó)外先進(jìn)水平或與國(guó)外存在差距的主要原因之一。因此，儀器學(xué)理論非常值得廣大科技工作者們重視。

3、從儀器學(xué)、分析化學(xué)和應(yīng)用實(shí)踐的要求來(lái)講，目前國(guó)產(chǎn)HPLC要求基本上都能滿(mǎn)足使用要求，并且深受?chē)?guó)外科技工作者青睞。國(guó)產(chǎn)高檔HPLC產(chǎn)品已經(jīng)出口到國(guó)外(包括發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家);而國(guó)人卻盲目迷信進(jìn)口HPLC，大量進(jìn)口國(guó)外的HPLC，中國(guó)的HPLC主市場(chǎng)仍被外國(guó)儀器占領(lǐng)，實(shí)在令人費(fèi)解。中國(guó)的科技工作者，應(yīng)該從民族高度看國(guó)產(chǎn)儀器和進(jìn)口儀器。在購(gòu)買(mǎi)、使用各類(lèi)HPLC儀器時(shí)，應(yīng)該要有愛(ài)國(guó)情懷，要有骨氣，要大膽使用能滿(mǎn)足使用要求的國(guó)產(chǎn)儀器。