10.做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？

1.用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移,有時(shí)發(fā)生快速變化,原因何在?如何解決?

關(guān)于漂移問(wèn)題

①溫度控制不好,解決方法是采用恒溫裝置,保持柱溫恒定

②流動(dòng)相發(fā)生変化,解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

③柱子未平衡好,需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡

關(guān)于快速變化問(wèn)題

①流速發(fā)生變化,解決辦法是重新設(shè)定流速,使之保持穩(wěn)定

②泵中有氣泡,可通過(guò)排氣等操作將氣泡趕出。

③流動(dòng)相不合適,解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合

2.為何會(huì)基線漂移

原因

①柱溫波動(dòng)。(即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線波動(dòng)。通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器。)

②流動(dòng)相不均勻。(流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。)

③流通池被污染或有氣體

④檢測(cè)器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂,產(chǎn)生噪音基線)

⑤流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化

⑥柱平衡慢,特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)

⑦流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

⑧樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高K值)以頭峰樣被洗脫出,從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。

⑨使用循環(huán)溶劑,不提倡。未調(diào)整檢測(cè)器。

⑩檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在zui大吸收波長(zhǎng)處。

解決方法

①控制好柱子和流動(dòng)相的溫度,在檢測(cè)器之前使用熱交換器。

②使用HPLC級(jí)的溶劑,高純度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣,使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。

③用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑中洗流通池。如有需要,可以用1N的的酸,(不要用鹽酸）。

④取出阻塞物或更換管子。參考檢測(cè)器手冊(cè)更換流通池窗。

⑤更改配比或流速。為避兔這個(gè)問(wèn)題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。

⑥用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗。更改流動(dòng)相時(shí),在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對(duì)試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。

⑦檢查流動(dòng)相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑。

⑧改變分析條件。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過(guò)程中,定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

⑨重新設(shè)定基線。使用新的流動(dòng)相。

⑩將波長(zhǎng)調(diào)整至zui大吸收波長(zhǎng)處。重選檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

①樣品量不足,解決方法為増加樣品量。

②樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子。

③樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢器

④檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可。

⑤檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)。

⑥檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。

⑦檢池中有氣泡。解決辦法為排氣。

4. 如何進(jìn)行色譜柱的維護(hù)？

①建議檢測(cè)前樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾。

②建議每天做完樣品后及時(shí)進(jìn)行清洗。

③常規(guī)檢測(cè)：測(cè)試完后直接把色譜柱反向連接采用90%有機(jī)相沖洗45min，zui后保存在純甲醇或純乙腈中。

④使用緩沖鹽條件：

a.等度條件：使用緩沖鹽之前和之后都用過(guò)渡流動(dòng)相以1ml/min流速?zèng)_洗45min

b.梯度條件：使用緩沖鹽之前與初始流動(dòng)相組成相同的過(guò)渡流動(dòng)相以1ml/min流速?zèng)_洗45min。

注意：過(guò)渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相比例與分析流動(dòng)相相同比例，只是不含有緩沖鹽。

c.緩沖鹽沖洗干凈后，采用90%有機(jī)相反向沖洗60min，zui后保存在純有機(jī)溶劑中。

注意：如果使用緩沖液不能存留色譜柱中過(guò)夜。

5.規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

原因

①在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣(尖銳峰)。

②漏液。

③流動(dòng)相混合不完全。

④溫度影響(柱溫過(guò)高,檢測(cè)器未加熱)。

⑤在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲）

⑥泵振動(dòng)

解決方法

①流動(dòng)相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。

②檢查管路接頭是否松動(dòng),泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換泵密封。

③用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑。

④減少差異或加上熱交換器。

⑤斷開(kāi)LC、檢測(cè)器和記錄儀,檢查干擾是否來(lái)自于外部,加以更正。采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。

⑥在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。

6.不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

原因

①漏液。

②流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成。

③流動(dòng)相各溶劑不相溶

④檢測(cè)器/記錄儀電子元件的問(wèn)題

⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

⑥檢測(cè)器內(nèi)有氣泡

⑦流通池污染(即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音。

⑧檢測(cè)器燈能量不足

⑨色譜柱填料流失或阻塞

⑩流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常

解決方法

①檢查接頭是否松動(dòng),泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封。檢查流通池是否漏液。

②檢査流動(dòng)相的組成。

③選擇互溶的流動(dòng)相

④斷開(kāi)檢測(cè)器和記錄儀的電源,檢查并更正。

⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)

⑥清洗檢測(cè)器,在檢測(cè)器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

⑦用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

⑧更換燈

⑨更換色譜柱

維修或更換混合器,在流動(dòng)相不走梯度時(shí),建議不使用泵的混合裝置

7.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí)，很傷柱子，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)？

答：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨)，之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如0.1％。

8.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？

①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
②存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子。
③可能柱超載，減少進(jìn)樣量。

9.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法是什么？

①樣品量不足，解決辦法為增加樣品量。
②樣品未從柱子中流出，可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子。
③樣品與檢測(cè)器不匹配，根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器。
④檢測(cè)器衰減太多，調(diào)整衰減即可。
⑤檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大，解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)。
⑥檢測(cè)器池窗污染，解決辦法為清洗池窗。
⑦檢測(cè)池中有氣泡，解決辦法為排氣。
⑧記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)，調(diào)整電壓范圍即可。
⑨流動(dòng)相流量不合適，調(diào)整流速即可。
⑩檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線，解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。

10.做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？

①泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理。
②比例閥失效，更換比例閥即可。
③泵密封墊損壞，更換密封墊即可。
④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法。
⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可。
⑥梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。

11.HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高，請(qǐng)問(wèn)為什么？

柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶zui常碰到的問(wèn)題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題，您可按下面步驟檢查問(wèn)題的起因：
①拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問(wèn)題，若柱壓仍高，再檢查。
②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查。
③將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查。只用于使用過(guò)的柱子。
④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說(shuō)明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過(guò)濾器便可避免柱壓過(guò)高的問(wèn)題。

12.為何出現(xiàn)峰展寬？

①樣品體積過(guò)大：用流動(dòng)相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%。
②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展:進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散。
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)。
④流動(dòng)相粘度過(guò)高:增加柱溫，采用低粘度流動(dòng)相。
⑤檢測(cè)池體積過(guò)大:用小體積池，卸下熱交換器。
⑥保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng):等度洗脫時(shí)增加強(qiáng)溶劑含量，也可用梯度洗脫。
⑦柱外體積過(guò)大:將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至zui小。
⑧樣品過(guò)載:進(jìn)小濃度小體積樣品。

13.流動(dòng)相出現(xiàn)氣泡的原因有哪些？

①流動(dòng)相溶液中往往因溶解有氧氣或空氣而形成氣泡。
②液路阻力比較大，吸液時(shí)出現(xiàn)了真空氣泡。
③系統(tǒng)開(kāi)始工作時(shí)未能將流路中的空氣排除干凈。
④在注入樣品時(shí)混入了空氣。

14.常用的實(shí)驗(yàn)室脫氣方式還有哪些？

①加熱回流脫氣，脫氣效果zui佳，但無(wú)法保持。

②氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價(jià)格太貴，所以用的不多。

③真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過(guò)程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失。

④超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實(shí)驗(yàn)室中zui常用。目前還是盡量爭(zhēng)取用在線脫氣，方便且效果好。

15.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí)，很傷柱子，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)？

答：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨)，之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如0.1％。