液相常見問題及對應(yīng)的解決方法

1.用HPLC進行分析時保留時間有時發(fā)生漂移,有時發(fā)生快速變化,原因何在?如何解決?

關(guān)于漂移問題

①溫度控制不好,解決方法是采用恒溫裝置,保持柱溫恒定

②流動相發(fā)生変化,解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

③柱子未平衡好,需對柱子進行更長時間的平衡

關(guān)于快速變化問題

①流速發(fā)生變化,解決辦法是重新設(shè)定流速,使之保持穩(wěn)定

②泵中有氣泡,可通過排氣等操作將氣泡趕出。

③流動相不合適,解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進行適當(dāng)混合

2.為何會基線漂移

原因

①柱溫波動。(即使是很小的溫度變化都會引起基線波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。)

②流動相不均勻。(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。)

③流通池被污染或有氣體

④檢測器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂,產(chǎn)生噪音基線)

⑤流動相配比不當(dāng)或流速變化

⑥柱平衡慢,特別是流動相發(fā)生變化時

⑦流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

⑧樣品中有強保留的物質(zhì)(高K值)以頭峰樣被洗脫出,從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。

⑨使用循環(huán)溶劑,不提倡。未調(diào)整檢測器。

⑩檢測器沒有設(shè)定在zui大吸收波長處。

解決方法

①控制好柱子和流動相的溫度,在檢測器之前使用熱交換器。

②使用HPLC級的溶劑,高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣,使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。

③用甲醇或其他強極性溶劑中洗流通池。如有需要,可以用1N的的酸,(不要用鹽酸）。

④取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

⑤更改配比或流速。為避兔這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

⑥用中等強度的溶劑進行沖洗。更改流動相時,在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。使用離子對試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。

⑦檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑。

⑧改變分析條件。使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中,定期用強溶劑沖洗柱子。

⑨重新設(shè)定基線。使用新的流動相。

⑩將波長調(diào)整至zui大吸收波長處。重選檢測波長。

3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

①樣品量不足,解決方法為増加樣品量。

②樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子。

③樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢器

④檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。

⑤檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)。

⑥檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。

⑦檢池中有氣泡。解決辦法為排氣。

4. 如何進行色譜柱的維護？

①建議檢測前樣品和流動相進行過濾。

②建議每天做完樣品后及時進行清洗。

③常規(guī)檢測：測試完后直接把色譜柱反向連接采用90%有機相沖洗45min，zui后保存在純甲醇或純乙腈中。

④使用緩沖鹽條件：

a.等度條件：使用緩沖鹽之前和之后都用過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min

b.梯度條件：使用緩沖鹽之前與初始流動相組成相同的過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min。

注意：過渡流動相是指有機相和水相比例與分析流動相相同比例，只是不含有緩沖鹽。

c.緩沖鹽沖洗干凈后，采用90%有機相反向沖洗60min，zui后保存在純有機溶劑中。

注意：如果使用緩沖液不能存留色譜柱中過夜。

5.規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

原因

①在流動相、檢測器或泵中有空氣(尖銳峰)。

②漏液。

③流動相混合不完全。

④溫度影響(柱溫過高,檢測器未加熱)。

⑤在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲）

⑥泵振動

解決方法

①流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。

②檢查管路接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換泵密封。

③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑。

④減少差異或加上熱交換器。

⑤斷開LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正。采用精密級穩(wěn)壓電源。

⑥在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。

6.不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

原因

①漏液。

②流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成。

③流動相各溶劑不相溶

④檢測器/記錄儀電子元件的問題

⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

⑥檢測器內(nèi)有氣泡

⑦流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。

⑧檢測器燈能量不足

⑨色譜柱填料流失或阻塞

⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常

解決方法

①檢查接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封。檢查流通池是否漏液。

②檢査流動相的組成。

③選擇互溶的流動相

④斷開檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正。

⑤用強極性溶液清洗系統(tǒng)

⑥清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

⑦用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

⑧更換燈

⑨更換色譜柱

維修或更換混合器,在流動相不走梯度時,建議不使用泵的混合裝置

7.氨基柱在進酸性樣品時，很傷柱子，如使用一段時間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)？

答：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨)，之后再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1％。

8.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？

①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
②存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子。
③可能柱超載，減少進樣量。

9.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法是什么？

①樣品量不足，解決辦法為增加樣品量。
②樣品未從柱子中流出，可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子。
③樣品與檢測器不匹配，根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器。
④檢測器衰減太多，調(diào)整衰減即可。
⑤檢測器時間常數(shù)太大，解決辦法為降低時間參數(shù)。
⑥檢測器池窗污染，解決辦法為清洗池窗。
⑦檢測池中有氣泡，解決辦法為排氣。
⑧記錄儀測壓范圍不當(dāng)，調(diào)整電壓范圍即可。
⑨流動相流量不合適，調(diào)整流速即可。
⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線，解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

10.做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？

①泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理。
②比例閥失效，更換比例閥即可。
③泵密封墊損壞，更換密封墊即可。
④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法。
⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可。
⑥梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

11.HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么？

柱壓過高是HPLC柱用戶zui常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因：
①拆去保護預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查。
②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查。
③將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查。只用于使用過的柱子。
④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。

12.為何出現(xiàn)峰展寬？

①樣品體積過大：用流動相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%。
②在進樣閥中造成峰擴展:進樣前后排出氣泡以降低擴散。
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點。
④流動相粘度過高:增加柱溫，采用低粘度流動相。
⑤檢測池體積過大:用小體積池，卸下熱交換器。
⑥保留時間過長:等度洗脫時增加強溶劑含量，也可用梯度洗脫。
⑦柱外體積過大:將連接管徑和連接管長度降至zui小。
⑧樣品過載:進小濃度小體積樣品。

13.流動相出現(xiàn)氣泡的原因有哪些？

①流動相溶液中往往因溶解有氧氣或空氣而形成氣泡。
②液路阻力比較大，吸液時出現(xiàn)了真空氣泡。
③系統(tǒng)開始工作時未能將流路中的空氣排除干凈。
④在注入樣品時混入了空氣。

14.常用的實驗室脫氣方式還有哪些？

①加熱回流脫氣，脫氣效果zui佳，但無法保持。

②氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多。

③真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失。

④超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中zui常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。

15.氨基柱在進酸性樣品時，很傷柱子，如使用一段時間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)？

答：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨)，之后再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1％。