厭氧性細(xì)菌的分離培養(yǎng)法

       厭氧菌需有較低的氧化—還原勢(shì)能才能生長(zhǎng)(例如破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌需氧化—還原電勢(shì)降低至0.11V時(shí)才開(kāi)始生長(zhǎng))，在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化—還原電勢(shì)較高，不適于厭氧菌的生長(zhǎng)。為使培養(yǎng)基降低勢(shì)，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十分必要的?，F(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多，主要有生物學(xué)，化學(xué)和物理學(xué)3種方法，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用。 

 1．生物學(xué)方法     

       培養(yǎng)基中含有植物組織(如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等)或動(dòng)物組織(新鮮無(wú)菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等)，由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而消耗氧氣(如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣，碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用，就是根據(jù)這個(gè)原理)，組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—還原電勢(shì)下降。          

      另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個(gè)平皿內(nèi)，利用需氧菌的生長(zhǎng)將氧消耗后，使厭氧菌能生長(zhǎng)。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌(如枯草桿菌)，另一半接種厭氧菌，接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37恒溫箱中培養(yǎng)2~3d后，即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長(zhǎng)。          

2．化學(xué)方法              

            利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收，或用還原氧化型物質(zhì)，降低氧化—還原電勢(shì)。             

李伏夫(B．M．JIbbob)法     

此法系用連二亞硫酸納(Sodium hydrosulphite)和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣，其反應(yīng)式如下：                    

      Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02          

         取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)(如系液體培養(yǎng)基，則直立于罐內(nèi))，*上端保留可容納1~2個(gè)平皿的空間(視玻罐的體積而定)，按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過(guò)濕，以免罐內(nèi)水分過(guò)多。若用無(wú)蓋玻罐，則可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無(wú)蓋玻罐罩于皿上，罐口周?chē)媚z泥或水銀封閉。  

          焦性沒(méi)食子酸法   焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣，同時(shí)由淡棕變?yōu)樯钭厣慕剐詻](méi)食臍(Purpurgallin)。每l00cm3空間用焦性沒(méi)食子酸1g及10％氫氧化納或氫氧化鉀l0ml，其具體方法主要有下列幾種：           

         （1）單個(gè)培養(yǎng)皿法：將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊，中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片，在其上放焦性沒(méi)食子酸0.2g及10％NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置于其上，周?chē)匀诨灮蚰z泥密封。將此玻璃板連同培養(yǎng)皿放人37C溫箱培養(yǎng)24~48h后，取出觀察。           

       （2）Buchner氏試管法：取一大試管，在管底放焦性沒(méi)食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個(gè)或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養(yǎng)管放人大試管中，迅速加入20％NaOH溶液0.5ml，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時(shí)周?chē)庖允灒?7培養(yǎng)24~48h后觀察。 

       （3）玻罐或干燥器法：置適量焦性沒(méi)食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，將培養(yǎng)皿或試管置于隔板上，并在玻罐內(nèi)置美藍(lán)指示劑一管，從罐側(cè)加入氫氧化鈉溶液放于罐底，將焦性沒(méi)食子酸用紙或紗布包好，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，待一切準(zhǔn)備好后．將線放下，使焦性沒(méi)食子酸落人氫 氧化納溶液中，立即將蓋蓋好；封緊，置溫箱中培養(yǎng)。 

        （4）瑞(Wright)氏法：將已接種細(xì)菌的培養(yǎng)管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌后，塞人管中離培養(yǎng)基1~1．5cm處，置適量焦性沒(méi)食子酸于其上，加入10％NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴(yán)密封閉置溫箱中培養(yǎng)。          

       （5）史(Spray)氏法：用厭氧培養(yǎng)皿，在皿底一邊置焦性沒(méi)食子酸，另一邊置氫氧化鈉溶液，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封完全，然后搖動(dòng)底部，使氫氧化鈉溶液與焦性沒(méi)食子酸混合，置溫箱中培養(yǎng)。    

        （6）平皿法：置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細(xì)菌，下面的平皿盛焦性沒(méi)食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封固后，置溫箱中培養(yǎng)。

    （7）硫乙醇酸鈉法   硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑，加入培養(yǎng)基中，能除去其中的氧或還原性物質(zhì)，促使厭氧菌生長(zhǎng)。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。                    A．液體培養(yǎng)基法：將細(xì)菌種人含0.1％的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24~48h后觀察，本培養(yǎng)基中加美藍(lán)液作為氧化還原的指示劑，在無(wú)氧條件下，美藍(lán)被還原成無(wú)色。                 

       Ｂ．固體培養(yǎng)基法：常采用特殊構(gòu)造的Brewer培養(yǎng)皿，可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)而形成孤立的菌落；操作過(guò)程是先將Brewer氏皿干熱滅菌，將溶化且冷卻至50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾人皿內(nèi)。待瓊脂冷凝后，將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內(nèi)緣與培養(yǎng)基外圍部分相互緊密接觸。此時(shí)皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鈉還原，故美藍(lán)應(yīng)逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，故仍呈藍(lán)色。將Brewer氏培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱內(nèi)，經(jīng)過(guò)24~48h后觀察。

     3．物理學(xué)方法     

利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧狀態(tài)，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育。                

  （1）厭氧罐法 :            

        常用的厭氧罐有Brewer氏罐，Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐）。將接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存的氧與氫經(jīng)鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個(gè)厭氧罐放人孵育箱培養(yǎng)。本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。                

      （２）真空干燥器法 :                

         將欲培養(yǎng)的平皿或試管放人真空干燥器中，開(kāi)動(dòng)抽氣機(jī)，抽至高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳?xì)怏w。將整個(gè)干燥器放進(jìn)孵育箱培養(yǎng)。              

     （３）高層瓊脂法:                     

       加熱融化高層瓊脂，冷至45℃左右接種厭氧菌，迅速混合均勻。冷凝后37℃培養(yǎng)，厭氧菌在近管底處生長(zhǎng)。                          

     （４）加熱密封法:                 

        將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏蒸鍋內(nèi)加熱l0min，驅(qū)除溶解于液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養(yǎng)基液面覆蓋一層約0.5cm的無(wú)菌凡士林石蠟，置37℃培養(yǎng)。此外，尚有搖振培養(yǎng)法，此處從略。                

     （５）二氧化碳培養(yǎng)法: 

      少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌(牛型)等，孵育時(shí)，需大氣中添加5％~10％二氧化碳，方能使之生長(zhǎng)繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；*簡(jiǎn)單的二氧化碳培養(yǎng)法是在盛放培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi)，燃點(diǎn)蠟燭，當(dāng)火焰熄滅時(shí)，該缸的大氣中，就約增加了5％~10％的二氧化碳。也可用化學(xué)物質(zhì)作用后生成二氧化碳，如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4％NaHCO3與30％H2SO4lmL，則可產(chǎn)生22.4mL的二氧化碳?xì)怏w。