光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域

  光學(xué)顯微鏡是一種既古老又年輕的科學(xué)工具，從誕生至今，已有三百年的歷史光學(xué)顯微鏡的用途十分廣泛，例如在生物學(xué)中，化學(xué)中，物理學(xué)中，天文等等在一些科研工作中都是離不開(kāi)顯微鏡。

  目前，幾乎成了科學(xué)技術(shù)的形象代言，你只需看媒體上有關(guān)科學(xué)技術(shù)的報(bào)道中頻頻出現(xiàn)其身影，便可見(jiàn)此言之不謬也。

    生物學(xué)中，實(shí)驗(yàn)室是離不開(kāi)這種實(shí)驗(yàn)儀器，它可以幫助學(xué)習(xí)者去研究未知的世界；去認(rèn)識(shí)世界。

     醫(yī)院是顯微鏡的最大應(yīng)用場(chǎng)所，主要用來(lái)檢查患者的體液變化、入侵人體的病菌、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的變化等等信息，為醫(yī)生提供制定治療方案的參考依據(jù)和驗(yàn)證手段，在基因工程、顯微外科手術(shù)中，顯微鏡更是醫(yī)生必備的工具；農(nóng)業(yè)方面，育種、病蟲(chóng)害防治等工作離不開(kāi)顯微鏡的幫助；工業(yè)生產(chǎn)中，精細(xì)零件的加工檢測(cè)和裝配調(diào)整、材料性能的研究是顯微鏡可以的顯身手的地方；刑偵人員常常依靠顯微鏡來(lái)分析各種微觀的罪跡，作為確定真兇的重要手段；環(huán)保部門檢測(cè)各種固體污染物時(shí)也得助顯微鏡；地礦工程師和文物考古工作者借助顯微鏡所發(fā)現(xiàn)的蛛絲馬跡可以判斷深埋地下的礦藏或推斷出塵封的歷史真像；甚至人們的日常生活也離不開(kāi)顯微鏡，如美容美發(fā)行業(yè)，能用顯微鏡對(duì)皮膚、發(fā)質(zhì)等進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)能獲得好的效果?？梢?jiàn)顯微鏡與人們的生產(chǎn)生活結(jié)合得是多么的緊密。

  按照不同的應(yīng)用目的，可以大致對(duì)顯微鏡進(jìn)行分類，常見(jiàn)的有生物顯微鏡、金相顯微鏡、體視顯微鏡、偏光顯微鏡等四大類。顧名思義，生物顯微鏡主要用在生物醫(yī)學(xué)方面，觀察對(duì)象多為透明或半透明微體；金相顯微鏡主要用來(lái)觀察不透明物體的表面，如材料的金相結(jié)構(gòu)和表面缺陷；體視顯微鏡在將微物放大成像的同時(shí)，還使物與像相對(duì)于人眼的方位一致，并且有縱深感，符合人的常規(guī)視覺(jué)習(xí)慣；偏光顯微鏡利用不同材料對(duì)偏振光的透射或反射特性來(lái)區(qū)分不同的微物組份。另外，還可細(xì)分出一些特殊的種類，如倒置生物顯微鏡或稱培養(yǎng)顯微鏡是主要用來(lái)透過(guò)培養(yǎng)器皿底部觀察培養(yǎng)的一種生物顯微鏡；熒光顯微鏡利用某些物質(zhì)吸收特定較短波長(zhǎng)光線而發(fā)射特定較長(zhǎng)波長(zhǎng)光線的特性，去發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)的存在，判斷其含量；比較顯微鏡可以在同一視場(chǎng)中形成兩個(gè)物體的并列或重合圖像，以便對(duì)比兩個(gè)物體的異同。

  傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡主要由光學(xué)系統(tǒng)及支撐它們的機(jī)械結(jié)構(gòu)組成，光學(xué)系統(tǒng)包括物鏡、目鏡和聚光鏡，都是由各種光學(xué)玻璃做成的復(fù)雜化了的放大鏡。物鏡將標(biāo)本放大成像，其放大倍率M 物由下式?jīng)Q定： M物 =Δ∕f'物，式中 f'物是物鏡的焦距， Δ可理解為物鏡與目鏡間的距離。目鏡將物鏡所成之像再次放大，成一個(gè)虛像在人眼前 250mm 處供人觀察, 這是多數(shù)人感覺(jué)舒適的觀察位置，目鏡的倍率M 目 =250/f' 目,f' 目是目鏡的焦距。顯微鏡的總放大倍率是物鏡與目鏡的乘積，即 M=M 物*M 目=Δ*250∕f' 目 *f; 物。可見(jiàn)，減小物鏡及目鏡焦距將使總放大倍率提高，這是用顯微鏡可以看到細(xì)菌等微生物的關(guān)鍵, 也是其與普通放大鏡的區(qū)別所在。

     那么，是否可以設(shè)想無(wú)限制地減少 f' 物f' 目，以便提高放大倍率，使我們能看到更加細(xì)微的物體呢 ? 回答是否定的！這是因?yàn)橛靡猿上竦墓獗举|(zhì)是一種電磁波，因而在傳播過(guò)程中免不了產(chǎn)生衍射和干涉現(xiàn)象，就像日常所見(jiàn)水面的波紋遇到障礙時(shí)能繞行，兩列水波相遇時(shí)能互相加強(qiáng)或削弱一樣。當(dāng)從一個(gè)點(diǎn)狀的發(fā)光物點(diǎn)發(fā)出的光波進(jìn)入物鏡時(shí)，物鏡的邊框阻礙了光的傳播，產(chǎn)生衍射和干涉，經(jīng)物鏡后無(wú)法再會(huì)集于一點(diǎn)，而是形成有一定大小的光斑，外圍還有強(qiáng)度微弱并逐漸減弱的一系列光環(huán)，我們稱中心亮斑為艾里斑，兩個(gè)發(fā)光點(diǎn)靠近到一定距離時(shí)兩光斑就會(huì)重疊，直至無(wú)法確認(rèn)為兩個(gè)光斑。瑞利提出了一個(gè)判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為當(dāng)兩光斑中心相距等于艾里斑半徑時(shí)，兩光斑是能分辨的，經(jīng)計(jì)算，這時(shí)候兩個(gè)發(fā)光點(diǎn)間的距離 e=0.61 入∕n.sinA=0.61 入 ∕N.A ，式中，入為光波波長(zhǎng)，人眼可接收的光波波長(zhǎng)約為0.4—0.7um ，n 為發(fā)光點(diǎn)所處介質(zhì)的折射率，如處在空氣中， n≈1 ，處在水中，n≈1.33 ，而 A 為發(fā)光點(diǎn)對(duì)物鏡邊框張角之半，N.A 稱為物鏡的數(shù)值孔徑。從上式可見(jiàn)，物鏡能分辨的兩點(diǎn)間的距離受到了光的波長(zhǎng)和數(shù)值孔徑的限制，由于人眼視覺(jué)最敏銳的波長(zhǎng)約為 0.5um ，而A 角不可能超過(guò)90 度， sinA 總小于1 ，對(duì)于可用的透光介質(zhì)最大折射率約為1.5 ，故 e 值始終大于0.2um ，這是光學(xué)顯微鏡能分辨的最小極限距離。通過(guò)顯微鏡放大成像，若想將能被具有某些 N.A 值的物鏡分辨率的物點(diǎn)間距e 放大到足以被人眼分辨，則需M.e≥0.15mm ，此處 0.15mm 為實(shí)驗(yàn)得出的人眼能分辨的置于眼前250mm 處兩微物間的最小距離，故 M≥ （0.15∕0.61 入）N.A≈500N.A ，為使觀察不致太費(fèi)力， M 擴(kuò)大一倍便足夠了，即500N.A≤M≤1000N.A ，是顯微鏡總倍率的合理選取范圍，再大的總放大倍率是沒(méi)有意義的，因?yàn)槲镧R數(shù)值孔徑已經(jīng)限制了最小可分辨距離，提高放大倍率已不可能分辨出更小的物體細(xì)節(jié)了。

   成像襯度是光學(xué)顯微鏡的另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，所謂襯度，即是像面上相鄰部份間的黑白對(duì)比度或顏色差，人眼對(duì)于0.02 以下的亮度差別是很難判定的，對(duì)顏色差別則稍微敏感一些。有些顯微鏡觀察對(duì)象，如生物標(biāo)本，其細(xì)節(jié)間亮度差別甚小，加之顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)制造誤差使其成像襯度進(jìn)一步降低而難于分辨，此時(shí)，看不清物體細(xì)節(jié)，不是總放大倍率過(guò)低，也不是物鏡數(shù)值孔徑太小，而是由于像面襯度太低的緣故。

  多少年來(lái)，人們?yōu)樘岣唢@微鏡的分辨能力和成像襯度付出了艱辛的勞動(dòng)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和工具的不斷進(jìn)步，光學(xué)設(shè)計(jì)的理論和方法也在不斷改進(jìn)，加上原材料性能的提高，工藝和檢測(cè)手段的不斷完善，觀察方法的創(chuàng)新，使光學(xué)顯微鏡的成像質(zhì)量已經(jīng)接近衍射極限的完善程度，人們將用標(biāo)本染色、暗場(chǎng)、相襯、熒光、干涉、偏光等觀察技術(shù)，使得光學(xué)顯微鏡已能適應(yīng)很多的研究，雖然近年來(lái)電子顯微鏡，超聲顯微鏡等放大成像儀器先后問(wèn)世，在某些方面具有優(yōu)勢(shì)的性能，但在廉價(jià)、方便、直觀、特別是適合生物活體的研究等方面仍無(wú)法與光學(xué)顯微鏡匹敵，光學(xué)顯微鏡仍然牢固地占據(jù)著自己的陣地。另一方面，與激光、計(jì)算機(jī)、新材料技術(shù)、信息技術(shù)相結(jié)合，古老的光學(xué)顯微鏡正煥發(fā)青春，顯示了旺盛的生命力，數(shù)碼顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、近場(chǎng)掃描顯微鏡、雙光子顯微鏡及具有各種新的功能或能適應(yīng)各種新的環(huán)境條件的儀器層出不窮，更加擴(kuò)大了光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域，作為新的例子。從火星探測(cè)車上傳回的巖層顯微圖片是多么令人振奮！我們完全可以相信，光學(xué)顯微鏡將會(huì)以更新的姿態(tài)，造福人類。

  由于近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡能克服傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡低分辨率以及掃描電子顯微鏡和掃描隧道顯微鏡對(duì)生物樣品產(chǎn)生損傷等缺點(diǎn)，因此得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，特別是在生物醫(yī)學(xué)以及納米材料和微電子學(xué)等領(lǐng)域。

  高分辨率光學(xué)成像由于近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡對(duì)所觀察的生物樣品無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于生物樣品的觀察，成為探索生物大分子活動(dòng)奧秘的光學(xué)手段，給生物學(xué)家們帶來(lái)強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)武器。利用近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡，已在生物學(xué)研究所涉及的許多領(lǐng)域展開(kāi)了工作，不僅有靜態(tài)的形貌像的觀察研究，如細(xì)胞的有絲分裂，染色體的分辨與局域熒光，原位 DNA，RNA 的測(cè)序，基因識(shí)別等，還有利用觀察形貌像隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程的研究。