光學顯微鏡的應用領域

  光學顯微鏡是一種既古老又年輕的科學工具，從誕生至今，已有三百年的歷史光學顯微鏡的用途十分廣泛，例如在生物學中，化學中，物理學中，天文等等在一些科研工作中都是離不開顯微鏡。

  目前，幾乎成了科學技術的形象代言，你只需看媒體上有關科學技術的報道中頻頻出現(xiàn)其身影，便可見此言之不謬也。

    生物學中，實驗室是離不開這種實驗儀器，它可以幫助學習者去研究未知的世界；去認識世界。

     醫(yī)院是顯微鏡的最大應用場所，主要用來檢查患者的體液變化、入侵人體的病菌、細胞組織結構的變化等等信息，為醫(yī)生提供制定治療方案的參考依據(jù)和驗證手段，在基因工程、顯微外科手術中，顯微鏡更是醫(yī)生必備的工具；農(nóng)業(yè)方面，育種、病蟲害防治等工作離不開顯微鏡的幫助；工業(yè)生產(chǎn)中，精細零件的加工檢測和裝配調(diào)整、材料性能的研究是顯微鏡可以的顯身手的地方；刑偵人員常常依靠顯微鏡來分析各種微觀的罪跡，作為確定真兇的重要手段；環(huán)保部門檢測各種固體污染物時也得助顯微鏡；地礦工程師和文物考古工作者借助顯微鏡所發(fā)現(xiàn)的蛛絲馬跡可以判斷深埋地下的礦藏或推斷出塵封的歷史真像；甚至人們的日常生活也離不開顯微鏡，如美容美發(fā)行業(yè)，能用顯微鏡對皮膚、發(fā)質(zhì)等進行檢測，當能獲得好的效果?？梢婏@微鏡與人們的生產(chǎn)生活結合得是多么的緊密。

  按照不同的應用目的，可以大致對顯微鏡進行分類，常見的有生物顯微鏡、金相顯微鏡、體視顯微鏡、偏光顯微鏡等四大類。顧名思義，生物顯微鏡主要用在生物醫(yī)學方面，觀察對象多為透明或半透明微體；金相顯微鏡主要用來觀察不透明物體的表面，如材料的金相結構和表面缺陷；體視顯微鏡在將微物放大成像的同時，還使物與像相對于人眼的方位一致，并且有縱深感，符合人的常規(guī)視覺習慣；偏光顯微鏡利用不同材料對偏振光的透射或反射特性來區(qū)分不同的微物組份。另外，還可細分出一些特殊的種類，如倒置生物顯微鏡或稱培養(yǎng)顯微鏡是主要用來透過培養(yǎng)器皿底部觀察培養(yǎng)的一種生物顯微鏡；熒光顯微鏡利用某些物質(zhì)吸收特定較短波長光線而發(fā)射特定較長波長光線的特性，去發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)的存在，判斷其含量；比較顯微鏡可以在同一視場中形成兩個物體的并列或重合圖像，以便對比兩個物體的異同。

  傳統(tǒng)的光學顯微鏡主要由光學系統(tǒng)及支撐它們的機械結構組成，光學系統(tǒng)包括物鏡、目鏡和聚光鏡，都是由各種光學玻璃做成的復雜化了的放大鏡。物鏡將標本放大成像，其放大倍率M 物由下式?jīng)Q定： M物 =Δ∕f'物，式中 f'物是物鏡的焦距， Δ可理解為物鏡與目鏡間的距離。目鏡將物鏡所成之像再次放大，成一個虛像在人眼前 250mm 處供人觀察, 這是多數(shù)人感覺舒適的觀察位置，目鏡的倍率M 目 =250/f' 目,f' 目是目鏡的焦距。顯微鏡的總放大倍率是物鏡與目鏡的乘積，即 M=M 物*M 目=Δ*250∕f' 目 *f; 物。可見，減小物鏡及目鏡焦距將使總放大倍率提高，這是用顯微鏡可以看到細菌等微生物的關鍵, 也是其與普通放大鏡的區(qū)別所在。

     那么，是否可以設想無限制地減少 f' 物f' 目，以便提高放大倍率，使我們能看到更加細微的物體呢 ? 回答是否定的！這是因為用以成像的光本質(zhì)是一種電磁波，因而在傳播過程中免不了產(chǎn)生衍射和干涉現(xiàn)象，就像日常所見水面的波紋遇到障礙時能繞行，兩列水波相遇時能互相加強或削弱一樣。當從一個點狀的發(fā)光物點發(fā)出的光波進入物鏡時，物鏡的邊框阻礙了光的傳播，產(chǎn)生衍射和干涉，經(jīng)物鏡后無法再會集于一點，而是形成有一定大小的光斑，外圍還有強度微弱并逐漸減弱的一系列光環(huán)，我們稱中心亮斑為艾里斑，兩個發(fā)光點靠近到一定距離時兩光斑就會重疊，直至無法確認為兩個光斑。瑞利提出了一個判定標準，認為當兩光斑中心相距等于艾里斑半徑時，兩光斑是能分辨的，經(jīng)計算，這時候兩個發(fā)光點間的距離 e=0.61 入∕n.sinA=0.61 入 ∕N.A ，式中，入為光波波長，人眼可接收的光波波長約為0.4—0.7um ，n 為發(fā)光點所處介質(zhì)的折射率，如處在空氣中， n≈1 ，處在水中，n≈1.33 ，而 A 為發(fā)光點對物鏡邊框張角之半，N.A 稱為物鏡的數(shù)值孔徑。從上式可見，物鏡能分辨的兩點間的距離受到了光的波長和數(shù)值孔徑的限制，由于人眼視覺最敏銳的波長約為 0.5um ，而A 角不可能超過90 度， sinA 總小于1 ，對于可用的透光介質(zhì)最大折射率約為1.5 ，故 e 值始終大于0.2um ，這是光學顯微鏡能分辨的最小極限距離。通過顯微鏡放大成像，若想將能被具有某些 N.A 值的物鏡分辨率的物點間距e 放大到足以被人眼分辨，則需M.e≥0.15mm ，此處 0.15mm 為實驗得出的人眼能分辨的置于眼前250mm 處兩微物間的最小距離，故 M≥ （0.15∕0.61 入）N.A≈500N.A ，為使觀察不致太費力， M 擴大一倍便足夠了，即500N.A≤M≤1000N.A ，是顯微鏡總倍率的合理選取范圍，再大的總放大倍率是沒有意義的，因為物鏡數(shù)值孔徑已經(jīng)限制了最小可分辨距離，提高放大倍率已不可能分辨出更小的物體細節(jié)了。

   成像襯度是光學顯微鏡的另一個關鍵問題，所謂襯度，即是像面上相鄰部份間的黑白對比度或顏色差，人眼對于0.02 以下的亮度差別是很難判定的，對顏色差別則稍微敏感一些。有些顯微鏡觀察對象，如生物標本，其細節(jié)間亮度差別甚小，加之顯微鏡光學系統(tǒng)設計制造誤差使其成像襯度進一步降低而難于分辨，此時，看不清物體細節(jié)，不是總放大倍率過低，也不是物鏡數(shù)值孔徑太小，而是由于像面襯度太低的緣故。

  多少年來，人們?yōu)樘岣唢@微鏡的分辨能力和成像襯度付出了艱辛的勞動，隨著計算機技術和工具的不斷進步，光學設計的理論和方法也在不斷改進，加上原材料性能的提高，工藝和檢測手段的不斷完善，觀察方法的創(chuàng)新，使光學顯微鏡的成像質(zhì)量已經(jīng)接近衍射極限的完善程度，人們將用標本染色、暗場、相襯、熒光、干涉、偏光等觀察技術，使得光學顯微鏡已能適應很多的研究，雖然近年來電子顯微鏡，超聲顯微鏡等放大成像儀器先后問世，在某些方面具有優(yōu)勢的性能，但在廉價、方便、直觀、特別是適合生物活體的研究等方面仍無法與光學顯微鏡匹敵，光學顯微鏡仍然牢固地占據(jù)著自己的陣地。另一方面，與激光、計算機、新材料技術、信息技術相結合，古老的光學顯微鏡正煥發(fā)青春，顯示了旺盛的生命力，數(shù)碼顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、近場掃描顯微鏡、雙光子顯微鏡及具有各種新的功能或能適應各種新的環(huán)境條件的儀器層出不窮，更加擴大了光學顯微鏡的應用領域，作為新的例子。從火星探測車上傳回的巖層顯微圖片是多么令人振奮！我們完全可以相信，光學顯微鏡將會以更新的姿態(tài)，造福人類。

  由于近場光學顯微鏡能克服傳統(tǒng)光學顯微鏡低分辨率以及掃描電子顯微鏡和掃描隧道顯微鏡對生物樣品產(chǎn)生損傷等缺點，因此得到了越來越廣泛的應用，特別是在生物醫(yī)學以及納米材料和微電子學等領域。

  高分辨率光學成像由于近場光學顯微鏡對所觀察的生物樣品無損傷等優(yōu)點，因此被廣泛應用于生物樣品的觀察，成為探索生物大分子活動奧秘的光學手段，給生物學家們帶來強有力的實驗武器。利用近場光學顯微鏡，已在生物學研究所涉及的許多領域展開了工作，不僅有靜態(tài)的形貌像的觀察研究，如細胞的有絲分裂，染色體的分辨與局域熒光，原位 DNA，RNA 的測序，基因識別等，還有利用觀察形貌像隨時間變化的動力學過程的研究。