Noldus Cognition Wall助力復旦腦院Cell子刊封面

全世界各個科研大國的腦計劃，起因于人們對行為及大腦探秘的高度關注。Nature不久前的一篇報道闡述到，中國腦科學研究所于2018年3月22日正式在北京成立，中國腦計劃實體店終開，北京大學饒毅與NIBS北京生命科學研究所羅敏敏共同主管。此舉也是繼2013年歐美的腦計劃、日本2014年的類似小的項目、韓國2016年后中國的跟進。北京市政府資助1.8億人民幣，五年內(nèi)招募約5-6個課題組約50名研究者，之后希望借助腦計劃每年大約需4億人民幣。不難看出，對大腦的研究是一個極其重要而艱難的任務，任重道遠，需要相關領域科研工作者貢獻自己的才智、見識與勤勉。本文接下來是對學習與記憶機制研究的相關文章進行解讀與闡釋。

TRPM7在不同發(fā)育階段對維持正常突觸密度以及學習記憶是必不可少的

在復旦大學腦科學研究院、醫(yī)學神經(jīng)生物學國家重點實驗室研究員那德（Nashat Abumaria）課題組的努力下，其研究成果發(fā)表在Cell Reports的封面上，影響因子IF為8.032，鑒于榮登封面，價值高于影響因子。

文章關注的是一種通道酶TRPM7，因為它在很多組織都有，這里關注的是它在CNS中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且是生理情況下非病理情況下的功能與角色,確切的是海馬區(qū)的神經(jīng)元Knockdown敲低以后發(fā)現(xiàn)突觸密度減少，但這一現(xiàn)象可以通過C端激酶區(qū)得到挽救，挽救的機制可能是磷酸化下游的cofilin蛋白(Cofilin是普遍存在于真核細胞的一種肌動蛋白結合蛋白.Cofilin的基本功能是在細胞內(nèi)結合和解聚F肌動蛋白)；出生后小鼠knockout敲除以后損傷了學習記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性，成年大鼠海馬區(qū)knockdown以后也損傷了學習記憶以及減少了突觸密度以及突觸可塑性；

為了研究這個通道酶對學習與記憶的影響，文章選取了小鼠與大鼠這兩種模式動物，為了細致觀察這種通道酶的功能，做了Knockdown敲低（針對成年大鼠）以及Knockout敲除（針對出生后小鼠）這兩種處理方式，輔以挽救實驗即在Knockout敲除的小鼠大腦內(nèi)又注射回該酶以觀察效果（針對小鼠，并針對該酶的部分區(qū)域即激酶區(qū)域），對于主要的衡量指標包括突觸密度、突觸可塑性以及學習與記憶行為，前兩種的衡量方法屬于比較常規(guī)的抗體染色顯微成像、體外電生理記錄，后一種課題組采用了荷蘭諾達思全新的Cognition Wall認知墻工具評判學習與記憶行為，值得關注。后面會具體談到。

1、體外細胞層面

首先體外情況如何，在細胞層面，Knockdown敲低TRPM7的表達，看看海馬體神經(jīng)元的情況，當然敲除后表達量減少了并且不影響其它蛋白的表達并且不影響神經(jīng)元的生長，另外關鍵的發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著減少，突觸素等也顯著下降! 

上圖左邊是對照組，右邊是敲低后的實驗組，可以看出各種重要染色顯示敲低后突觸密度、突觸素顯著下降。上面的諸多敲低后的結果到底是什么在起作用，于是展開挽救實驗，提高鎂離子和鋅離子濃度，不行，甚至發(fā)現(xiàn)后來兩者的細胞內(nèi)濃度與TRPM7無關了，看來非離子通道在突觸密度減少起作用；后來加入C端激酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著提高！

上面六張熒光圖，第二張即是加入C端激酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)突觸密度顯著提高，而第三張是突變了的C端激酶發(fā)現(xiàn)就不能提高，其特異性可見！

2、動物模型層面

進入到小鼠與大鼠的動物階段！

采用特定knockout的小鼠，大腦特定區(qū)域基因敲除了TRPM7看看實際的個體層面的情況，檢查一些基本的行為參數(shù)比如運動活性、探索新物體的動機，這些都是正常的。新物體識別的認知參數(shù)，敲掉后小鼠明顯下降。學習認知實驗中，敲除后的小鼠明顯學習能力下降，只有40%的小鼠學會了認知墻實驗，學習階段獲取了更少的顆粒獎勵，記憶階段更少地做出了正確的選擇。而且CA1區(qū)域(海馬體的一個區(qū)域)的突觸密度也顯著下降。并且突觸前末端密度減少、突觸后場興奮電位下降，這些都表明基因敲除的小鼠突觸的可塑性受損了。

圖1：

圖2：

圖1左邊是黑色的是對照組的突觸密度，右邊黑色的是敲除組的突觸密度，明顯下降！圖2測定的是場興奮性突觸后電位，黑色的是對照組的LTP長時程增強，紅色的是敲除組的LTP長時程增強，明顯突出的可塑性受損！

這些突觸密度的下降、突觸可塑性的受損，反應到行為學上則是學習認知的問題。

采用荷蘭諾達思的Cognition Wall認知墻工具進行學習認知行為的研究  

Cognition Wall認知墻工具包含EthoVision軟件系統(tǒng)以及PhenoTyper小鼠家居箱以及三孔認知墻等。動物從特定的入口進入（上圖顯示綠色的入口），則軟件自動給予食物獎勵（上圖藍色的顆粒顯示）該實驗全程自動，不需要人為干預，軟件自動控制硬件并自動記錄數(shù)據(jù)并自動分析數(shù)據(jù)。

實驗如下：

實驗前一周小鼠在標準的鼠籠單籠飼養(yǎng)；

• 實驗開始前11個小時前將小鼠放入小鼠家居箱，讓其適應環(huán)境，即大約晚上8:30將小鼠放入，可以進水限制進食；
• 這個適應階段放入10粒食物，使小鼠能找到食物給予的地方
• 早上7:30放入認知墻，早上8:00開始實驗，全程自動進行；
• 這個過程小鼠需要連續(xù)進入左邊的孔5次則軟件自動控制硬件給予一粒食物（即上圖綠色的孔）。

Tip: 本文的小鼠節(jié)律是晚上8點開燈至第二天早上8點關燈，后期采用紅色昏暗的燈光作為晚上時間，即light phase 8:00pm-8:00am dark phase 8:00am-8:00pm其中dark phase為實驗進行時段。

以下圖示為實驗結果：

從從結果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠只有40%的學會了認知墻！對照組全部學會！對比明顯！在一天后的記憶測試階段，將小鼠重新放回帶有認知墻的家居箱，在1個小時的測試中計算小鼠做出正確選擇的比例（即從左邊孔進入）。

從結果可以看出，基因敲除的紅色線的小鼠做出正確選擇的比例明顯低于對照組。

為了確保食物獎勵的裝置沒有問題，實驗者亦手動數(shù)了每只小鼠在學習過程中獲得的食物獎勵的數(shù)目，因為食物獎勵的數(shù)目與小鼠的學習能力是相關的。

明顯，基因敲除的小鼠獲取食物獎勵的數(shù)目少于對照組，學習能力明顯弱于對照組。

沒有完！在小鼠模型上注射C端激酶的病毒進行挽救實驗，對照組、激酶組、突變激酶組，一個月后做行為學測試后處死進一步分析，新物體識別的認知參數(shù)，對照組和激酶組都明顯高于突變激酶組。學習認知實驗中，對照組和激酶組都明顯學習得更快，記憶測試也更多地做出了正確的選擇。當然突觸密度與突觸可塑性均高于突變組。

這和最開始的細胞實驗對應了起來，在動物模型上并且是行為實驗上驗證了C端激酶對學習記憶的關鍵作用。

當然以大鼠為模型，在特定knockdown的大鼠，確定敲低其表達以后，同樣基本的行為參數(shù)是沒有差異的，后測定大鼠的學習與記憶能力，T迷宮空間學習實驗（敲低后做出正確選擇的比例明顯下降）、短期再認記憶（過去經(jīng)驗或識記過的事物再次呈現(xiàn)在面前時仍能確認和辨認出來的過程）也受損、背景記憶也受損，當然突觸密度與突觸可塑性均明顯下降 。

最后一個話題，文獻報道過cofilin參與的一些功能和TRPM7敲除后很類似，提出假設在學習認知層面TRPM7可能借助cofilin參與了下游的機制，發(fā)現(xiàn)敲除后cofilin磷酸化（抑制）顯著減少，而激酶組的cofilin確實磷酸化得到了恢復，并驗證了兩者是直接結合的。

當然下游這塊研究還是比較簡單，偏向于現(xiàn)象的關聯(lián)，未能直接與學習記憶做深入研究。另外，激酶的功能是通過突觸前、突觸后來調(diào)控突觸密度的機制也需要進一步闡明。

海馬體（左）與海馬（右）

參考文獻：

Liu YQ#,Chen C# ,Liu YL#,Li W, Wang ZH,Sun QF,Zhou H,Chen XJ,Yu YC,Wang Y, Nashat Abumaria*. (2018) TRPM7 Is Required for Normal Synapse Density, Learning, and Memory at Different Developmental Stages .Cell Reports.23(12):3480–3491

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