質(zhì)譜檢測法與蛋白質(zhì)分析的“前世今生”

　　【中國化工儀器網(wǎng) 市場分析】質(zhì)譜分析法是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域和生物大分子研究領(lǐng)域中最重要的分析技術(shù)。由于我們對(duì)蛋白質(zhì)鑒定、定量和分析的要求越來越高，希望檢測技術(shù)的靈敏度也越來越高，同時(shí)能夠?qū)Ω鼮閺?fù)雜的樣品進(jìn)行分析處理，因此推動(dòng)了質(zhì)譜檢測技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一大批新興的質(zhì)譜分析方法和儀器。本文將對(duì)近幾年質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展以及質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)領(lǐng)域研究工作中的應(yīng)用進(jìn)行一個(gè)詳細(xì)的介紹。
 

　　在生命科學(xué)研究工作中有一個(gè)重要問題，就是發(fā)現(xiàn)、鑒定蛋白質(zhì)并弄清楚它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)。知道了蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息，我們就可以通過遺傳密碼將其與編碼序列對(duì)應(yīng)起來，從原則上來說，也就將細(xì)胞的生理學(xué)與遺傳學(xué)聯(lián)系起來了。發(fā)現(xiàn)、鑒定出了一個(gè)蛋白質(zhì)就好像給我們打開了一扇窗，透過這個(gè)窗口，我們就能夠?qū)?fù)雜的細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有所了解。
 

　　在基因組學(xué)大步發(fā)展之前，我們就已經(jīng)能夠使用化學(xué)方法或酶學(xué)方法來鑒定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)了，不過當(dāng)時(shí)只能對(duì)單一的、高度純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。我們當(dāng)時(shí)通常采用的方法都是檢測紫外線吸光度(ultraviolet absorbance)或熒光光譜分析(fluorescentspectroscopy)的方法。比如用化學(xué)逐步降解法，即Edman法來鑒定時(shí)是從蛋白質(zhì)多肽的N端逐步降解至C端，在降解的過程中通過檢測紫外線吸光度的辦法來辨認(rèn)每一個(gè)被降解下來的氨基酸殘基。不過在近20年里，有一種新方法——質(zhì)譜檢測法開始逐步進(jìn)入到蛋白質(zhì)鑒定領(lǐng)域。質(zhì)譜法與化學(xué)法結(jié)合，為我們提供了更多有用的信息。隨著質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，質(zhì)譜法逐漸成為了蛋白質(zhì)鑒定方面的首選方法。到了上世紀(jì)90年代中期，質(zhì)譜檢測法已經(jīng)取代了Edman法，成為鑒定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的主流方法。
 

　　隨著人類基因組項(xiàng)目的開展，大家對(duì)質(zhì)譜技術(shù)的需求也變得越來越大。人類基因組項(xiàng)目讓我們看到，我們可以對(duì)復(fù)雜的生物系統(tǒng)進(jìn)行全面的高通量分析。而且人類基因組項(xiàng)目還向我們提供了大量的完整基因編碼序列，這對(duì)于幫助我們大量、快速鑒定蛋白質(zhì)序列來說意義重大。于是，繼基因組項(xiàng)目之后，又迅速出現(xiàn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的概念，即對(duì)細(xì)胞或組織中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，質(zhì)譜技術(shù)同樣是必不可少的一項(xiàng)重要技術(shù)。
 

　　不過要對(duì)“所有的”蛋白質(zhì)進(jìn)行分析實(shí)在是一項(xiàng)非常棘手的任務(wù)。雖然我們的技術(shù)在不斷進(jìn)步，但到目前為止，我們還不可能對(duì)任何一個(gè)物種的“所有”蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。該任務(wù)最大的難點(diǎn)在于任何一個(gè)蛋白質(zhì)組都非常復(fù)雜，而且我們對(duì)其復(fù)雜程度一無所知。我們所知道的是，任何一個(gè)物種蛋白質(zhì)組組成單位(蛋白質(zhì))的數(shù)量都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其基因組中所有基因的數(shù)量。
 

　　這是因?yàn)?，一個(gè)基因可以通過可變剪接的方式、序列多態(tài)性方式、翻譯后修飾方式以及其它蛋白質(zhì)處理機(jī)制等形成多個(gè)蛋白質(zhì)。而且，這些數(shù)量眾多的蛋白質(zhì)各自的濃度差別也非常大，目前沒有一款儀器或者方法能夠?qū)?dòng)態(tài)范圍如此大的樣本群體進(jìn)行分析。比如我們曾預(yù)計(jì)血清蛋白質(zhì)的濃度差別可能超過了10個(gè)數(shù)量級(jí)。雖然分析血清蛋白這個(gè)任務(wù)也非常困難，但是這還是推動(dòng)了蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展。本文將向您介紹幾種質(zhì)譜檢測技術(shù)，它們在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域的應(yīng)用情況，并對(duì)它們在蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作中的價(jià)值進(jìn)行討論。
 

　　質(zhì)譜檢測儀以及它們的應(yīng)用范圍
 

　　長期以來，質(zhì)譜技術(shù)只能用來分析一些耐熱的小化合物，因?yàn)槲覀儺?dāng)時(shí)還無法有效地、溫和地使樣品離子化，也無法有效地在不導(dǎo)致樣品斷裂的前提下將離子化的樣品從固態(tài)轉(zhuǎn)變成氣態(tài)。在上世紀(jì)80年代末誕生了兩項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步，即電噴射離子化技術(shù)(electrospray ionization, ESI)和基質(zhì)輔助激光解析離子化技術(shù)(matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI)。這兩項(xiàng)技術(shù)解決了生物大分子的離子化問題，它們的出現(xiàn)，極大地推動(dòng)了質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，我們終于可以使用質(zhì)譜技術(shù)來分析蛋白質(zhì)組成問題了。隨后又催生出了一大批新型的用于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的質(zhì)譜檢測儀，比如Q-Q-ToF質(zhì)譜儀(Hybrid quadrupoletime-of-flight instrument)和ToF-ToF質(zhì)譜儀(tandem time-of-flightinstrument)等(表1)。質(zhì)譜儀不僅能夠檢測蛋白質(zhì)多肽的分子量和氨基酸序列，還能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)以及翻譯后修飾情況。在檢測蛋白質(zhì)多肽的分子量和氨基酸序列時(shí)，使用單級(jí)質(zhì)譜儀(single-stage mass spectrometers)就足夠了，而在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)以及翻譯后修飾情況時(shí)除了進(jìn)行單級(jí)質(zhì)譜檢測之外，還會(huì)選擇特殊的離子通過碰撞對(duì)其進(jìn)行裂解分析。在這種串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry, MS/MS)檢測試驗(yàn)中，我們可以通過對(duì)蛋白質(zhì)裂解片段的分析獲取詳細(xì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。我們下面將要介紹的質(zhì)譜儀都是在蛋白質(zhì)研究中最常用到的儀器。這些質(zhì)譜儀之間在物理原理、性能指標(biāo)、操作模式以及應(yīng)用范圍方面各有差異。
 

　　表1 各種常見質(zhì)譜儀性能簡介;表中√表示具有該功能，(√)表示可選該功能。+、++和+++分別表示可能或適度、好或很好、優(yōu)秀或非常優(yōu)秀;Seq表示連續(xù)的。
 

　　飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和hybrid ToF質(zhì)譜儀
 

　　在ToF質(zhì)譜儀中，我們可以通過某個(gè)離子飛越一段長度真空管道的時(shí)間推算出它的質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio)?，F(xiàn)在，ToF質(zhì)譜儀的性能已經(jīng)得到了很大的提升，尤其是在分辨率和準(zhǔn)確性方面進(jìn)步最為明顯?，F(xiàn)在，分辨力超過12，000已經(jīng)是質(zhì)譜儀的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)了。如果按照正確的操作規(guī)程，也可以達(dá)到百萬分之一(ppm)級(jí)別的準(zhǔn)確率。ToF質(zhì)譜儀是進(jìn)行ESI質(zhì)譜和MALDI質(zhì)譜檢測的基礎(chǔ)平臺(tái)。Q-Q-ToF質(zhì)譜儀在MS模式和MS/MS模式下就具有非常高的分辨率和準(zhǔn)確率。在MS模式下，四級(jí)桿(quadrupole)起到了引導(dǎo)離子飛行的作用。而在MS/MS模式下，母離子(precursor ions)，即在ESI過程中產(chǎn)生的離子被“挑選”出來，進(jìn)入第一對(duì)四級(jí)桿，而后在第二對(duì)四級(jí)桿中借助碰撞誘導(dǎo)解離作用(collision-induced dissociation)被裂解。然后，裂解離子產(chǎn)物經(jīng)由ToF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析處理。不論是完全掃描模式(full-scan)還是MS/MS模式，得到的質(zhì)譜圖都具有很高的準(zhǔn)確率和分辨率，這也就意味著能獲得更多的肽段信息，發(fā)現(xiàn)單一同位素信號(hào)(mono-isotopic signal)的離子狀態(tài)和指派(assignment)信息。所有這些信息都給蛋白質(zhì)鑒定工作帶來了極大的便利。有了上述這些信息，再與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，就能找出檢測蛋白質(zhì)樣品的資料。Q-Q-ToF質(zhì)譜儀在定量分析方面以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況分析方面的能力也同樣出色。
 

　　MALDI技術(shù)是另一項(xiàng)非常有用的待測蛋白質(zhì)樣品離子化技術(shù)，通常都會(huì)將MALDI技術(shù)與ESI技術(shù)相互補(bǔ)充使用。MALDI質(zhì)譜儀靈敏度非常高，同時(shí)，對(duì)樣品污染(比如，鹽離子污染或少量去垢劑污染等)的要求沒有ESI質(zhì)譜儀那么苛刻。最開始，MALDI技術(shù)是與ToF質(zhì)譜儀聯(lián)合使用用來檢測蛋白質(zhì)分子量的。后來又被應(yīng)用到Q-Q-ToF質(zhì)譜儀和ToF-ToF質(zhì)譜儀上，這樣才實(shí)現(xiàn)了真正的MS/MS檢測。在單電荷(singlycharged)母離子的質(zhì)譜圖和ToF-ToF質(zhì)譜儀得到的質(zhì)譜圖中都能發(fā)現(xiàn)高能量的碰撞裂解片段，這些片段都是蛋白質(zhì)多肽肽鍵斷裂和側(cè)鏈斷裂形成的，這些信號(hào)都很容易被解析。
 

　　離子阱質(zhì)譜儀(Ion trap，IT)
 

　　在離子阱質(zhì)譜儀中，可以捕獲離子，因此也可以積累離子。離子阱技術(shù)具有無法比擬的高靈敏度和快速數(shù)據(jù)采集能力。將離子阱技術(shù)與數(shù)據(jù)依賴性采集技術(shù)(data-dependent acquisition)結(jié)合起來，我們就能進(jìn)行高通量的質(zhì)譜檢測。不過，離子阱質(zhì)譜儀的分辨率有限，捕獲離子的能力不高，再加上空間電荷效應(yīng)(space-charging effect)的影響，因此離子阱質(zhì)譜儀的檢測準(zhǔn)確度不夠高。改進(jìn)型的線性離子阱質(zhì)譜儀(linear ion trap analyzers, LIT)具有更高的離子捕獲能力，更寬廣的動(dòng)態(tài)范圍和更高的靈敏度?，F(xiàn)在，線性離子阱質(zhì)譜儀已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的四級(jí)桿捕獲設(shè)備。我們通常都會(huì)使用線性離子阱質(zhì)譜儀中的慢速掃描功能來提高分辨率。離子阱質(zhì)譜儀也都具有多階段連續(xù)MS/MS功能，有了這種功能，我們能夠反復(fù)分離、裂解某些離子片段，這是發(fā)現(xiàn)諸如磷酸化等翻譯后修飾情況的好方法。
 

　　線性離子阱質(zhì)譜儀技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用到三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(triple quadrupole–type instrument)當(dāng)中，這種新型的質(zhì)譜儀具有了許多新的功能。Q-Q-LIT質(zhì)譜儀就是這種三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，它具有母離子掃描功能和中性丟失掃描功能，同時(shí)該質(zhì)譜儀的敏感度也有所提高(圖1B、C)。這些新型的質(zhì)譜儀為我們提供了分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況的“利器”。此外，Q-Q-LIT質(zhì)譜儀具有的多重反應(yīng)監(jiān)測能力(multiplereaction monitoring, MRM)能夠幫助我們發(fā)現(xiàn)母離子與某一片段之間的轉(zhuǎn)換情況。將這種MRM技術(shù)與高效能循環(huán)(high duty cycle)結(jié)合起來，就能獲得無與倫比的敏感性，并且能夠進(jìn)行定量分析。
 

　　Ion source：離子源;MS1：第一個(gè)質(zhì)譜儀;CID：碰撞誘導(dǎo)解離;MS2: 第二個(gè)質(zhì)譜儀;
 

　　Product ion scanning：離子產(chǎn)物掃描法;fixed:固定; scanning：掃描;m/z：質(zhì)荷比;
 

　　Precursor ion scanning: 母離子掃描法;time：時(shí)間;
 

　　Neutral loss scanning: 中性丟失掃描法;Multiple ion monitoring: 多離子監(jiān)測法;
 

圖1 各種串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法原理示意圖。
 

　　A：離子產(chǎn)物掃描法(Production scanning)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究里最常用的MS/MS質(zhì)譜檢測策略。該方法的目的就是要獲得蛋白質(zhì)片段離子的質(zhì)譜圖，然后據(jù)此鑒定出蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在本試驗(yàn)中，第一個(gè)質(zhì)譜儀MS1是用來篩選出某一特定的母離子。隨后，被選出的母離子在碰撞池中經(jīng)由碰撞誘導(dǎo)解離作用(collision-induceddissociation, CID)被進(jìn)一步裂解成更小的片段，然后這些小片段分子經(jīng)由第二個(gè)質(zhì)譜儀MS2進(jìn)行分析、鑒定。對(duì)不同的母離子反復(fù)進(jìn)行這種分析最終就可以獲得蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列。
 

　　B：母離子掃描法。在這里，第二個(gè)質(zhì)譜儀MS2只對(duì)一個(gè)母離子進(jìn)入檢測。第一個(gè)質(zhì)譜儀MS1對(duì)所有母離子進(jìn)行掃描后挑選出一個(gè)母離子進(jìn)入MS2。通常來說，該方法適用于檢測某一樣品中包含特殊功能基團(tuán)的蛋白質(zhì)亞群，這些基團(tuán)包括磷酸酯基團(tuán)或糖基化修飾基團(tuán)等。
 

　　C：性丟失掃描法(Neutralloss scanning)能夠以同步的(synchronized)方式同時(shí)對(duì)兩種待測樣品進(jìn)行分析。分子量不同的各種離子可以持續(xù)不斷地通過MS1和MS2。在碰撞池中，不符合分子量要求的中性片段分子都被篩掉了。因此，該方法適用于分析樣品中具有某種特定功能的多肽。該方法最常應(yīng)用的領(lǐng)域是發(fā)現(xiàn)被磷酸化修飾的絲氨酸或蘇氨酸位點(diǎn)。
 

　　D：離子監(jiān)測法(Multipleion monitoring, RM)是由一系列的實(shí)驗(yàn)組成的。MS1和MS2會(huì)分別挑選出一母離子和一特定的能代表該母離子的片段分子。然后，經(jīng)由一系列的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化操作(母離子——小片段分子配對(duì)操作)，最后收集實(shí)驗(yàn)信號(hào)(色譜洗脫時(shí)間)以供結(jié)果分析。MRM方法適合對(duì)復(fù)雜樣品中已知片段特性的特定樣品進(jìn)行分析。
 

　　離子回旋加速器與軌道離子阱質(zhì)譜儀
 

　　隨著功能強(qiáng)大的帶有外部離子源的傅里葉變換-離子回旋加速器(FT-ICR)質(zhì)譜儀的出現(xiàn)以及商業(yè)化，我們在質(zhì)譜儀的分辨率與準(zhǔn)確性方面取得了質(zhì)的飛躍。有了這種新型的質(zhì)譜儀，我們現(xiàn)在可以對(duì)ppm級(jí)乃至亞ppm級(jí)的樣品進(jìn)行分析了。該質(zhì)譜儀的高分辨率特性不僅提高了數(shù)據(jù)結(jié)果的質(zhì)量，同時(shí)也增加了峰容量(peak capacity)，因此相比傳統(tǒng)的低分辨率質(zhì)譜儀，F(xiàn)T-ICR質(zhì)譜儀能夠獲取更多的信息。配有外部LIT設(shè)備的“雜交” FT-ICR質(zhì)譜儀(hybrid FT-ICR instrument)的發(fā)展更是提高了該質(zhì)譜儀的分析能力，同時(shí)也賦予傳統(tǒng)的低分辨率MS/MS質(zhì)譜儀更好的探測母離子的能力。將FT-MS質(zhì)譜儀與LIT-ICR“雜交”質(zhì)譜儀結(jié)合，就能獲得真正意義上的平行全質(zhì)譜檢測儀(parallel full mass spectrum)MS1和串聯(lián)(而非連續(xù))質(zhì)譜儀(tandem not sequential mass spectrum)MS2。高質(zhì)量的MS1檢測結(jié)果可以用于定量研究。這種策略唯一的缺點(diǎn)就是相對(duì)比較低的數(shù)據(jù)采集速度(平均每個(gè)循環(huán)只能獲得幾個(gè)數(shù)據(jù))和IT設(shè)備造成的動(dòng)態(tài)范圍較窄。
 

　　最近，出現(xiàn)了一種新型的軌道離子阱(orbitrap)質(zhì)譜儀。這是30年來上市的第一款使用最新物理技術(shù)的質(zhì)譜儀，該質(zhì)譜儀能分離振蕩電場(oscillating electric field)中的離子。在分辨率和準(zhǔn)確率方面軌道離子阱質(zhì)譜儀與FT-ICR質(zhì)譜儀不相上下，但是它不需要FT-ICR質(zhì)譜儀使用的昂貴的超導(dǎo)磁鐵(superconductingmagnet)。
 

　　MS-MS操作模式
 

　　串聯(lián)質(zhì)譜儀通常使用的都是離子模式來鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列(圖1A)。目前所有的MS/MS質(zhì)譜儀都具有該功能。不過表1中列舉的其它特殊的質(zhì)譜儀也具有MS/MS功能。如果要發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中的某個(gè)功能基團(tuán)則需要用到母離子掃描功能或者中性丟失掃描功能，而這就必須用到三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，如，Q-Q-Q質(zhì)譜儀，或四級(jí)桿離子阱質(zhì)譜儀，如，Q-Q-LIT質(zhì)譜儀。比如復(fù)雜混合物里的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)就都可以用這種方法(在碰撞池中產(chǎn)生特殊的報(bào)告離子，通過它來進(jìn)行特殊的功能檢測)檢測出來。在一個(gè)典型的質(zhì)譜檢測試驗(yàn)中，首先先用母離子掃描或中性丟失掃描都能發(fā)現(xiàn)目標(biāo)組分，然后再用傳統(tǒng)的MS/MS方法鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及定位修飾位點(diǎn)。
 

　　三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀在MRM模式下也能以極高的敏感度進(jìn)行定量分析。已知的或未知的分析物都以極高的敏感度和選擇性能被定量檢測出來(圖1D)。這種高選擇性得益于質(zhì)譜儀能夠?qū)Υ硪粋€(gè)肽段的一對(duì)母離子和片段裂解物離子進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。而且，在MRM模式下進(jìn)行的兩輪選擇過程會(huì)極大地提高檢測的靈敏度，因?yàn)椋谝惠喓Y選過后只能剩下很少的離子，這也就將背景噪聲減小到了最低水平。碰撞誘導(dǎo)解離片段離子(collision-induced dissociation fragment ions，CID)來源于母離子，這些CID離子能夠產(chǎn)生離散信號(hào)，而背景化學(xué)噪聲信號(hào)則是隨機(jī)分布的。最后，由于這種采樣時(shí)間很長的技術(shù)固有的非掃描本質(zhì)使得它的敏感度非常高，相比離子掃描技術(shù)的探測極限(LOD)要高出好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
 

　　質(zhì)譜儀的性能
 

　　我們已經(jīng)在表1中對(duì)各種質(zhì)譜儀的性能進(jìn)行了一個(gè)概括?？傮w來說，質(zhì)譜儀的性能包括分辨率、敏感度或探測極限和準(zhǔn)確性等，這些性能都與質(zhì)譜儀的類型、采用的離子化方法和掃描能力有關(guān)。不過沒有哪一個(gè)儀器能同時(shí)在上述所有方面都全面占優(yōu)，在選擇儀器的時(shí)候必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行相應(yīng)的取舍。
 

　　對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器性能的比較一直以來都是一個(gè)存在很多爭議的話題。因?yàn)樾阅苁欠?wù)于需求的，是取決于待測樣品和實(shí)驗(yàn)步驟的。質(zhì)譜儀對(duì)單獨(dú)肽段樣品進(jìn)行檢測時(shí)敏感度總是很低，不過如果生物樣品的基質(zhì)背景(matrix background)很高，那么檢測的敏感度就會(huì)提高好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。這種同一款儀器在性能上表現(xiàn)出來的“不穩(wěn)定性”其實(shí)很常見，在儀器處于不同操作條件或狀態(tài)下時(shí)(比如，在最優(yōu)條件下，常規(guī)條件下和大批量處理?xiàng)l件下)它們的性能表現(xiàn)都是不同的。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖牵合脒M(jìn)行定量分析還是蛋白質(zhì)鑒定，這也決定了該使用哪種儀器。在蛋白質(zhì)鑒定試驗(yàn)中，儀器的分辨率(能很好地區(qū)分不同組分)和準(zhǔn)確性是最主要的，而在定量研究中，敏感度、動(dòng)態(tài)范圍和MRM能力才是最主要的。因此，我們應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰约皩?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排來確定該使用哪種質(zhì)譜儀。
 

　　要想用全掃描模式(full scanmode)獲取定量數(shù)據(jù)的同時(shí)再用MS/MS模式獲取定性數(shù)據(jù)是一件非常困難的事情。不過某些“雜交”質(zhì)譜儀，比如LIT-ICR質(zhì)譜儀，由于它們能夠平行采集數(shù)據(jù)，因此可以部分解決上面那個(gè)問題。精確的定量分析需要源自整個(gè)洗脫圖(entire elution profile)的高質(zhì)量的、高信噪比的數(shù)據(jù)信息。數(shù)據(jù)質(zhì)量與數(shù)據(jù)采集參數(shù)高度相關(guān)，這些數(shù)據(jù)采集參數(shù)包括掃描時(shí)間或者采樣時(shí)間(對(duì)于非掃描質(zhì)譜儀而言)。因此，我們經(jīng)常需要在數(shù)據(jù)質(zhì)量和樣品處理能力(量)之間做出取舍。
 

　　最新進(jìn)展
 

　　最近又有幾項(xiàng)有關(guān)質(zhì)譜儀的最新進(jìn)展問世，這些新成果的出現(xiàn)又給我們的生物大分子研究工作補(bǔ)充了“彈藥”。在蛋白質(zhì)測序方面，基于碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)(CID)，又新出現(xiàn)了可變裂解技術(shù)(Alternate fragmentation technique)，該新技術(shù)是基于處在碰撞池中的離子具有的電子傳遞特性開發(fā)出來的。目前，電子捕獲解離技術(shù)(ECD)和電子傳遞解離技術(shù)(ETD)都已經(jīng)分別被應(yīng)用到FT-ICR質(zhì)譜儀和LIT質(zhì)譜儀上了。運(yùn)用這兩種技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物能與經(jīng)典的CID方法裂解產(chǎn)物互為補(bǔ)充。不過這兩種新方法裂解更均勻，更適合用于發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾情況。ECD技術(shù)和ETD技術(shù)還都可以用于大型肽段和蛋白質(zhì)的研究。他們的裂解能力和對(duì)完整蛋白的分析能力可以幫助我們直接用質(zhì)譜儀對(duì)完整的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，即可以采用所謂的“自上而下(top-down)”的方法進(jìn)行研究。這樣，我們能夠獲得完整的氨基酸序列信息和翻譯后修飾信息，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行最準(zhǔn)確的鑒定。
 

　　傳統(tǒng)的和最新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略
 

　　雖然到目前為止，還沒有一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略能夠?qū)δ硞€(gè)蛋白質(zhì)組進(jìn)行常規(guī)的、完整的分析，但是現(xiàn)在的技術(shù)已經(jīng)非常強(qiáng)大，我們相信，很快就能進(jìn)行全蛋白質(zhì)組學(xué)研究了。而且，對(duì)某個(gè)亞蛋白質(zhì)組(比如某個(gè)細(xì)胞器或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組)進(jìn)行研究早就已經(jīng)不是什么難題了，這已經(jīng)成為了一種常規(guī)的研究手段。不過，蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法也需要視研究目的而做出相應(yīng)的調(diào)整，不能千篇一律，比如，有很多研究都是描述性的研究項(xiàng)目，主要的關(guān)注點(diǎn)都著眼在發(fā)現(xiàn)、鑒定出蛋白質(zhì)以及這些蛋白質(zhì)的翻譯后修飾情況，而最近又開始逐漸興起蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究了。
 

　　實(shí)際上，每一個(gè)以質(zhì)譜檢測為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作都包括以下3大部分：(i)分離、消化蛋白質(zhì)樣品，然后對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步裂解;(ii)對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜定性和定量檢測;(iii)用相應(yīng)的軟件對(duì)質(zhì)譜檢測結(jié)果進(jìn)行分析處理，獲得蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且如果可能的話，進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)的鑒定工作主要由MS-MS質(zhì)譜儀負(fù)責(zé)，然后通過將質(zhì)譜檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，最后確定出蛋白質(zhì)的氨基酸序列。需要提醒的是，對(duì)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析工作是保證結(jié)果正確性的關(guān)鍵。
 

　　對(duì)純化蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析
 

　　下面，我們用最“古老”的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法——2維凝膠電泳法(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)結(jié)合質(zhì)譜分析法對(duì)純化蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析的策略為例進(jìn)行介紹(圖2A)。首先，待測目標(biāo)蛋白經(jīng)消化、酶解之后經(jīng)由質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，通常使用的都是MALDI-ToF質(zhì)譜儀來獲取肽鏈指紋圖譜(peptidemass fingerprint)。最近，出現(xiàn)了好幾種該策略的改進(jìn)方法，即將各種連續(xù)電泳分離方法(sequential electrophoretic separation method)或色譜分離方法(chromatographic separation method)結(jié)合進(jìn)來，以提高質(zhì)譜檢測時(shí)的峰容量，這樣就提高了對(duì)復(fù)雜樣品的分辨率。定量分析則是在蛋白質(zhì)水平通過比較不同樣品中目標(biāo)蛋白的信號(hào)強(qiáng)度來完成的。這種策略的優(yōu)劣取決于它們區(qū)分相關(guān)(近)蛋白質(zhì)的能力，即分辨率的高低，比如要能夠區(qū)分出經(jīng)不同類型修飾的蛋白質(zhì)，還取決于待測樣品的復(fù)雜程度。這種研究策略最大的問題是動(dòng)態(tài)范圍太窄，而且處理樣品的能力也不夠高，不具備高通量分析的功能，因此不足以進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。而且，一些比較重要的蛋白質(zhì)，比如膜蛋白等還不能用該方法進(jìn)行分析，因?yàn)樵摲椒ㄖ荒苡糜诜治鰪?fù)雜度比較低的樣品，或者用于對(duì)某一特定蛋白進(jìn)行分析的實(shí)驗(yàn)。
 

　　對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測
 

　　對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測時(shí)也用到了人類基因組研究項(xiàng)目中用到的“鳥槍法”策略。即首先將蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行裂解，這樣獲得的多肽片段才能夠用于自動(dòng)化MS/MS分析，我們常用的是快速掃描設(shè)備如IT質(zhì)譜儀(圖2B)。用這種方法可以對(duì)完整細(xì)胞裂解物或組織提取物進(jìn)行分析，也可以對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、提純的細(xì)胞器或其它亞蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行檢測。
 

　　如果給待測樣品帶上穩(wěn)定的同位素標(biāo)記，我們就可以對(duì)樣品中不同蛋白質(zhì)的豐度進(jìn)行檢測了，這些蛋白質(zhì)可能在化學(xué)性質(zhì)方面是一樣的，但是我們可以通過不同的同位素信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分(圖3A)。也可以使用如圖3B中所示的串聯(lián)標(biāo)記(tandem mass tag)方法對(duì)樣品進(jìn)行多次質(zhì)譜分析。還可以在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前往待測樣品中添加定量的同位素標(biāo)記肽段，以獲得樣品準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)(圖3C)。
 

　　這種“鳥槍法”最大的優(yōu)勢就是簡單，不論從理論層面來說還是從實(shí)驗(yàn)操作層面來說都很簡單，該方法相比前面所述的各種方法能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)組分進(jìn)行更大程度的覆蓋，同時(shí)定量的準(zhǔn)確性更高。不過該方法也有其局限性，具體表現(xiàn)在動(dòng)態(tài)范圍不夠，難以使用生物信息學(xué)方法從大量的、高冗余的、復(fù)雜的蛋白質(zhì)組樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)中推斷出蛋白質(zhì)序列。幸好這些問題已經(jīng)部分得到了解決，通過裂解的方法可以降低樣品的復(fù)雜程度。常用的裂解方法主要針對(duì)的都是蛋白質(zhì)組中生物信息學(xué)資料豐富的部分，比如富含半胱氨酸的肽段、磷酸化的肽段、糖基化的肽段等等。這種“鳥槍法”策略最適合用于快速鑒定復(fù)雜樣品中的組分，也非常適合用于對(duì)不同樣品中同一蛋白質(zhì)的定量比較研究。在“鳥槍法”策略中，在蛋白質(zhì)水解過程里，不同肽段間的聯(lián)系信息以及肽段與其來源蛋白質(zhì)間的聯(lián)系信息都已經(jīng)丟失了，因此該方法不太適合用于對(duì)具有多重修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定工作。
 

　　Protein(s)：待測蛋白質(zhì)樣品;Enz.Digestion：酶解;Pep. Mixture：裂解產(chǎn)物混合物;
 

　　MS Analysis：質(zhì)譜檢測分析;DB Search：數(shù)據(jù)庫比對(duì)搜索;Identities：鑒定;
 

　　Prot.DB ：蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫;Proteome：蛋白質(zhì)組;Sample prep：樣品準(zhǔn)備(裂解);
 

　　LC/MS& MS/MS：LC/MS以及 MS/MS分析;Quantification：定量研究;
 

　　Abundances：豐度;List of targets：挑選出待測樣品;Pep.lib：待測靶樣品;
 

　　圖2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略示意圖。
 

　　A：經(jīng)由2維電泳或pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的待測蛋白質(zhì)樣品prot隨即被酶解，然后用質(zhì)譜儀對(duì)酶解片段pep進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析。最后根據(jù)肽質(zhì)指紋圖譜(PMF)鑒定出肽段以及它們的來源蛋白。其它的MS/MS數(shù)據(jù)也能用來進(jìn)行肽段鑒定。
 

　　B：隨機(jī)蛋白質(zhì)鑒定和定量分析方法，即鳥槍法。該方法可以對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行鑒定以及定量研究。被選出的肽段如圖1A中所示，經(jīng)過串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行離子掃描分析。在這里，母離子是被隨機(jī)選出的，通常母離子的裂解片段中只有一個(gè)片段能夠被檢測到，也就是說存在采樣不足的問題。MS1質(zhì)譜儀采集到的離子強(qiáng)度信息與參考分子信息比對(duì)可以進(jìn)行定量分析，這里使用的參考分子通常都會(huì)標(biāo)記上穩(wěn)定的同位素標(biāo)簽。
 

　　C：定量研究方法能去除蛋白質(zhì)定量研究與鑒定過程中的干擾信號(hào)。首先，MS1質(zhì)譜儀會(huì)通過比對(duì)不同樣品的肽模式，即肽段分子量相對(duì)色譜保留時(shí)間作圖的結(jié)果，挑選出不同樣品間豐度不同的肽段。然后被挑出的肽段進(jìn)入下一輪MS/MS質(zhì)譜檢測。
 

　　D：基于各種假說的檢測方法。該方法可以對(duì)各種預(yù)先被設(shè)定肽段的豐度進(jìn)行高精度的檢測，我們通常都是根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來挑選這些靶肽段。在這里常用的方法是圖1D中所示的MRM方法。如果在試驗(yàn)中選用合適的參考肽段會(huì)進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
 

　　比較模式分析
 

　　圖2C中所示的比較模式分析法其實(shí)在原理上與2維電泳方法是相似的，就像在2維電泳中一樣，每一個(gè)蛋白質(zhì)都是一個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)，可以借此對(duì)它們進(jìn)行定量和定性的分析。而且還可以進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，比如進(jìn)行蛋白質(zhì)測序或進(jìn)行翻譯后修飾情況鑒定等。不過在以質(zhì)譜檢測手段為基礎(chǔ)的分析方法中，蛋白質(zhì)樣品首先需要被降解、片段化，然后再用液相色譜-質(zhì)譜儀LC/MS進(jìn)行分析。借助色譜洗脫時(shí)間和分子量這兩個(gè)參數(shù)，我們就可以鑒定出一個(gè)多肽離子。將所有離子的數(shù)量信息整合起來就得到了蛋白質(zhì)的定量信息。這種方法主要的優(yōu)勢在于它可以對(duì)質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)的所有信息進(jìn)行定量處理。與“鳥槍法”相比這是非常明顯的優(yōu)勢，因?yàn)樵?ldquo;鳥槍法”里，只能對(duì)被鑒定出來的肽段進(jìn)行定量化處理。不過在實(shí)際運(yùn)用過程中，這種比較模式分析方法的重復(fù)性很差，也沒有非常好的配套軟件對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析。用這種方法可以獲得一些數(shù)據(jù)，根據(jù)這些數(shù)據(jù)能夠推測出蛋白質(zhì)序列，這些數(shù)據(jù)包括質(zhì)荷比(m/z)、帶電荷狀態(tài)、洗脫時(shí)間以及離子強(qiáng)度等。需要被測序的多肽(比如在兩個(gè)樣品中表達(dá)豐度不同的同一蛋白質(zhì))會(huì)出現(xiàn)在檢測結(jié)果列表中，然后，我們會(huì)將該蛋白(多肽)進(jìn)行新一輪的直接質(zhì)譜檢測，專門只采集它的MS/MS質(zhì)譜圖信息。這種研究方法也可用于MALDI/MS/MS質(zhì)譜檢測平臺(tái)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)樣品都被“固定”在樣品板上，因此可以對(duì)它們進(jìn)行不受時(shí)間限制的連續(xù)檢測。
 

　　基于各種假說的研究策略
 

　　隨著各種質(zhì)譜儀技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們有理由相信會(huì)出現(xiàn)敏感度更高、處理速度更快、更可靠的蛋白質(zhì)組研究設(shè)備。不過目前我們還不清楚這些技術(shù)上的進(jìn)步是否足以突破當(dāng)下蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作中的瓶頸。以前我們曾認(rèn)為蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略需要進(jìn)行有效的變革才能全面、有力的對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究和分析。這種變革的核心就是改變以往那種在每一次試驗(yàn)中都對(duì)既往結(jié)果進(jìn)行重復(fù)研究的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，新的研究策略是根據(jù)既往的研究成果來設(shè)計(jì)、指導(dǎo)進(jìn)行新的實(shí)驗(yàn)研究項(xiàng)目。我們預(yù)計(jì)與人類基因組計(jì)劃一樣，將來也會(huì)獲得某個(gè)物種的完整蛋白質(zhì)組序列圖譜，未來蛋白質(zhì)組的研究目標(biāo)應(yīng)該是對(duì)蛋白質(zhì)(多肽)進(jìn)行具有特定目的的、非冗余的分析研究。對(duì)于質(zhì)譜技術(shù)和質(zhì)譜儀器的發(fā)展來說，這種研究策略的轉(zhuǎn)變需要有更好的檢測設(shè)備和檢測手段(流程)做依托，要能夠以更快的速度、更高的靈敏度和更強(qiáng)大的分析能力進(jìn)行質(zhì)譜檢測?，F(xiàn)在也出現(xiàn)了可供序列組裝、修飾情況查詢的數(shù)據(jù)庫。可以預(yù)計(jì)，在不久的將來，各種生物學(xué)假說將會(huì)給我們設(shè)定出許多待檢測的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。我們可以將這些蛋白質(zhì)的信息錄入數(shù)據(jù)庫，構(gòu)成一個(gè)檢測這些假說所必需的極小集蛋白質(zhì)信息簇。然后，可以用各種方法，比如MRM方法對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(圖2D)。因?yàn)檫@種研究方法主要是對(duì)非冗余靶標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜檢測，所以，在檢測的敏感度方面和樣品處理能力方面都有很大的提高。如果再配合定量的、標(biāo)準(zhǔn)化的同位素標(biāo)記參考肽段，還可以進(jìn)行精確的定量分析。
 

　　上述這種研究策略最適合用于Q-Q-LIT質(zhì)譜儀這類被我們使用了幾十年，主要用于檢測小分子藥品和體內(nèi)藥物代謝研究領(lǐng)域的三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀。在研究藥物代謝時(shí)使用的研究方法同樣適用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域。
 

　　作為上述方法的一個(gè)補(bǔ)充，Smith又開發(fā)出另一種使用精確分子量標(biāo)簽來鑒定蛋白質(zhì)的方法。該方法首先測定待測物質(zhì)的分子量，然后將數(shù)據(jù)與分子量數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，以此來鑒定蛋白質(zhì)。這樣就無需再對(duì)每一個(gè)樣品中的每一條多肽進(jìn)行測序了。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷開展，我們積累的數(shù)據(jù)也越來越多，并且數(shù)據(jù)積累的速度也越來越快，同時(shí)，各種分析軟件的功能也越來越強(qiáng)大，因此我們相信，基于各種假說的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略一定會(huì)被更多的人所接受，所采用。
 

　　Labeling：標(biāo)記 Tag：標(biāo)記物 Peptide：肽段 Mixing：混合 Analysis：分析
 

　　MS：質(zhì)譜檢測 light：較輕的片段 heavy：較重的片段 Time：時(shí)間
 

　　Tandem mass tag：串聯(lián)標(biāo)簽 MS/MS：MS/MS模式 m/z：質(zhì)荷比
 

　　No labeling!：為標(biāo)記 MRM：MRM方法
 

　　Internal standards(isotopically labeled peptides)：內(nèi)參，即同位素標(biāo)記的肽段
 

　　圖3 肽段定量分析策略示意圖
 

　　A：同位素稀釋法是進(jìn)行肽段定量分析時(shí)最常用的一種方法，該方法也是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)常用的一個(gè)方法。該方法的原理是在一號(hào)樣品所有的待測蛋白質(zhì)上都帶上一個(gè)穩(wěn)定的同位素標(biāo)簽，同時(shí)在二號(hào)樣品所有的待測蛋白質(zhì)上都帶上另一個(gè)穩(wěn)定的同位素標(biāo)簽。這樣，這兩組樣品就可以互為參照了。可以借助化學(xué)的方法，例如穩(wěn)定的同位素編碼標(biāo)簽試劑、代謝標(biāo)記反應(yīng)和酶標(biāo)反應(yīng)等對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行同位素標(biāo)記。
 

　　B：使用串聯(lián)標(biāo)簽進(jìn)行定量研究。該方法同樣需要各種穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物。這些同位素標(biāo)記物由兩種同位素標(biāo)記元素組成，它們都有固定的分子量。目前，這些試劑可用于四通道反應(yīng)。通過在質(zhì)譜儀的MS/MS模式下檢測連接在蛋白質(zhì)N端報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)強(qiáng)度以及CID圖譜中低分子量范圍里的信號(hào)可以獲得待測蛋白質(zhì)的定量信息。
 

　　C：使用內(nèi)參進(jìn)行定量研究的方法。該方法實(shí)際上也是一種同位素稀釋法。在該方法中會(huì)往待測樣品中添加一種已知濃度的同位素標(biāo)記的肽段，然后借助標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行精確的定量分析。雖然該方法樣品制備過程較為復(fù)雜，但是它的前景非常光明。它非常適合用于基于各種假說的檢測方法。
 

　　小結(jié)
 

　　在過去的十年里，是蛋白質(zhì)分析，更準(zhǔn)確的說應(yīng)該是蛋白質(zhì)組學(xué)分析推動(dòng)了質(zhì)譜檢測技術(shù)的發(fā)展。各種技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)使質(zhì)譜儀在準(zhǔn)確度、分辨力、敏感度、定量分析能力等各方面都有了長足的進(jìn)展，蛋白質(zhì)組質(zhì)譜檢測策略方面也有了新突破。分析完整蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合體、低豐度蛋白質(zhì)等各種樣品的檢測操作流程層出不窮。
 

　　編輯點(diǎn)評(píng)
 

　　質(zhì)譜分析法是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域和生物大分子研究領(lǐng)域中最重要的分析技術(shù)。質(zhì)譜檢測技術(shù)推動(dòng)了生物大分子(包括代謝產(chǎn)物、脂類物質(zhì)、碳水化合物等等)領(lǐng)域的研究。因此，我們有理由相信，質(zhì)譜檢測技術(shù)必將在生物研究的各個(gè)領(lǐng)域里占有重要的一席之地。
 

　　(原標(biāo)題：質(zhì)譜檢測法與蛋白質(zhì)分析)