液相色譜柱進(jìn)展及其在藥品標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用（一）

　　液相色譜柱進(jìn)展及其在藥品標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用（一）

——液相色譜柱及其填料種類(lèi)

　　高效液相色譜法(HPLC)已成為藥物分析，特別是多組分分析和雜質(zhì)控制中最重要、最廣泛的分析技術(shù)之一。伴隨著理論體系不斷完善，分離方法不斷更新，儀器性能不斷改進(jìn)，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，液相色譜分析技術(shù)已經(jīng)、正在和必將繼續(xù)飛速發(fā)展。就技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展而言，主要包括儀器性能、數(shù)據(jù)處理以及色譜柱技術(shù)等方面的提高和改進(jìn)。如今，色譜柱技術(shù)的不斷改進(jìn)創(chuàng)新，填料種類(lèi)的日益豐富，分離模式和分離方法的逐步完善，為分離分析科學(xué)描繪了一幅幅絢麗的圖景。由于色譜柱是液相色譜分離的核心，開(kāi)發(fā)新型或高性能的高效液相色譜填料(又稱(chēng)為填充劑、固定相)，提供多種色譜柱類(lèi)型一直是色譜研究中最豐富、最有活力、最富于創(chuàng)造性的內(nèi)容。本文將主要討論液相色譜柱及其填料的進(jìn)展分類(lèi)，以及在藥品標(biāo)準(zhǔn)、特別是在藥典中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

　　1　液相色譜柱及其填料種類(lèi)

　　改善分離度和色譜峰形一直是分析工作者關(guān)注的主要問(wèn)題，通過(guò)改變流動(dòng)相組成來(lái)提高色譜柱的選擇性是分析工作中常用的手段。不過(guò)，由于改變流動(dòng)相如有機(jī)相比例、pH、緩沖鹽濃度等以提高色譜柱的選擇性或分離能力有限，為適應(yīng)日益增加的分離要求，開(kāi)發(fā)選擇性更高、性能更優(yōu)越的色譜柱就成為液相色譜法的研究熱點(diǎn)之一。如今，為適應(yīng)分離工作數(shù)量和難度的需求，越來(lái)越多的色譜固定相被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并不斷地被應(yīng)用于實(shí)際分析包括藥物分析工作中。色譜柱填料的基質(zhì)、形狀、尺寸、類(lèi)型、直徑、孔徑、比表面積等因素將影響色譜柱的性能。為便于理解，下文按不同的方式對(duì)色譜柱或填料進(jìn)行分類(lèi)。

　　1.1　按色譜填料種類(lèi)不同分類(lèi)

　　按基質(zhì)材料化學(xué)組成的不同，液相色譜填料主要分為兩大類(lèi)：有機(jī)基質(zhì)填料和無(wú)機(jī)基質(zhì)填料。無(wú)機(jī)基質(zhì)填料是研究和應(yīng)用的主流，其中應(yīng)用最多的材料是硅膠，其具有機(jī)械強(qiáng)度高，比表面積大及表面易于修飾等特點(diǎn)，是開(kāi)發(fā)最早，研究最為深入，應(yīng)用最為廣泛的液相色譜填料，其應(yīng)用占液相色譜填料的90%以上。硅膠表面覆蓋著強(qiáng)極性的硅醇基，在非極性流動(dòng)相中與樣品分子發(fā)生作用，也可以作為化學(xué)鍵合相的反應(yīng)位點(diǎn)。因此，硅膠、鍵合硅膠是正反相液相色譜法中最常用的色譜柱填充劑。

　　最初使用的硅膠填料是無(wú)定形微粒硅膠，無(wú)定形硅膠易于制備，價(jià)格低廉，但渦流擴(kuò)散大，滲透性差，柱效不高，重現(xiàn)性較差。20世紀(jì)70年代，科克蘭(J. J. Kirkland)采用硅珠堆砌技術(shù)制備全多孔球形ZORBAX 硅膠，該填料平均粒徑約7微米，具有更好的滲透性、比表面積和更高的柱效，而且球形填料易于填裝，重現(xiàn)性好。到1995年，在分析色譜中不定型填料基本被5-10微米的球形顆粒填料取代，前者因?yàn)閮r(jià)格便宜，主要是用于制備色譜分離;現(xiàn)在的分析色譜中，球形顆粒硅膠基質(zhì)的色譜填料已經(jīng)占絕對(duì)地位。

　　硅膠基質(zhì)分為A型硅膠和B型硅膠：A 型硅膠金屬含量較高，導(dǎo)致硅膠純度較低，且酸性較強(qiáng)，從而導(dǎo)致色譜峰拖尾和某些化合物回收率很差;B 型硅膠是通過(guò)全合成獲得的填料，稱(chēng)之為高純硅膠，可有效地控制金屬離子的含量(一般控制在0.05%以內(nèi))，避免活性化合物在色譜柱上與金屬離子產(chǎn)生螯合，也降低了硅醇基的活性，有利于避免堿性化合物拖尾。另外，為了提高硅膠基質(zhì)的穩(wěn)定性，在硅膠表面進(jìn)行有機(jī)改性，如聚合物包覆，或引入有機(jī)雜化基團(tuán)，可以使基質(zhì)填料表面的部分硅羥基被有機(jī)基團(tuán)代替，從而提高pH 耐受性，也能降低堿性化合物的拖尾。

　　有機(jī)基質(zhì)填料主要分為多糖型和聚合物型兩大類(lèi)，前者是以天然多糖化合物為原料，用物理方法加工成微球并經(jīng)過(guò)交聯(lián)而得到的凝膠，如葡聚糖、瓊脂糖等基質(zhì)的凝膠，主要用于凝膠滲透色譜(GPC)。后者以合成單體與交聯(lián)劑為原料，用化學(xué)聚合方法制備的交聯(lián)高聚物微球，如苯乙烯- 二乙烯基苯共聚物以及聚甲基丙烯酸酯類(lèi)樹(shù)脂等，有機(jī)聚合物填料排除了硅醇基的影響，具有較強(qiáng)的色譜容量，不容易產(chǎn)生不可逆的非特異性吸附，有較好的化學(xué)穩(wěn)定。

　　1.2　按鍵合相種類(lèi)不同分類(lèi)

　　中國(guó)藥典(0512 高效液相色譜法)按鍵合相種類(lèi)不同分類(lèi)如下：

　　反相色譜柱：以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見(jiàn)的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等;常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)和苯基鍵合硅膠等。

　　正相色譜柱：用硅膠填充劑或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱。常見(jiàn)的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等，在使用正相體系時(shí)，一般都采用弱極性的溶劑作為流動(dòng)相。此類(lèi)極性固定相如硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等也可使用含水的流動(dòng)相，此時(shí)化合物的保留隨著流動(dòng)相中水的比例增加而減弱，這種分離模式稱(chēng)為親水作用液相色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)。

　　離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽(yáng)離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

　　手性拆分色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。

　　在中國(guó)藥典分類(lèi)所述的各類(lèi)色譜柱中，反相色譜柱是應(yīng)用最廣泛、最常見(jiàn)的一種。

　　1.3　按色譜柱填料粒徑大小分類(lèi)

　　根據(jù)色譜填料粒徑的大小，色譜柱可分為常規(guī)色譜柱、亞2 微米填料色譜柱和大粒徑色譜柱。常規(guī)的色譜柱內(nèi)徑一般為3.9~4.6 mm，填充劑粒徑為3~10微米。限于儀器系統(tǒng)、載樣量、柱效、分離度等因素的影響，5微米粒徑，4.6 mm×250 mm 尺寸的色譜柱依然是常規(guī)液相分析中最廣泛的色譜柱尺寸。但在常規(guī)液相體系中使用3微米或3.5微米的填料時(shí)，可在獲得較快分析速度的同時(shí)，節(jié)省溶劑，故又稱(chēng)溶劑節(jié)省柱。

　　亞2微米填料色譜柱通常填充1.3~2.0微米 的顆粒填料，色譜柱內(nèi)徑一般為2.1~3.0 mm，長(zhǎng)度一般為30~150 mm。由于這樣的色譜柱填料粒徑小，在液相系統(tǒng)中會(huì)產(chǎn)生極高的反壓，壓力通常大于40 MPa，故需要在更高的超高壓(或超高效)液相色譜系統(tǒng)中使用。

　　大粒徑色譜柱(粒徑大于10微米)現(xiàn)主要用于制備色譜分離純化，即制備色譜柱;或者用于大分子物質(zhì)分析如凝膠滲透色譜或體積排阻色譜(GPC/SEC)。用于大分子物質(zhì)，如聚合物、蛋白、單抗等分析時(shí)，一般相對(duì)分子質(zhì)量都大于2000，采用的色譜填料孔徑應(yīng)大于300 。

　　1.4　按色譜柱填料結(jié)構(gòu)類(lèi)型分類(lèi)

　　在色譜分離過(guò)程中，溶質(zhì)分子與固定相間的傳質(zhì)速率通常被其在色譜柱填料中的擴(kuò)散所左右。顆粒形狀和大小，孔的結(jié)構(gòu)、孔徑及其分布等與比表面積有關(guān)。按照色譜填料孔結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要有無(wú)孔型、全多孔型和表面多孔型。

　　無(wú)孔型的填料表面無(wú)孔，消除了溶質(zhì)在孔內(nèi)較慢地?cái)U(kuò)散傳質(zhì)引起的譜帶展寬效應(yīng)，可提高柱效，但由于其比表面積非常小，載樣量也很小，故應(yīng)用不多。一般使用非常細(xì)的填料(1~1.5 微米)，填充于較長(zhǎng)的色譜管柱中，用于大分子物質(zhì)分析。

　　全多孔型填料是在硅膠制備過(guò)程中形成的多孔硅膠，多孔體系的形成有利于提高溶質(zhì)在固定相中的分配和保留，具有柱容量大和選擇范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。全多孔型填料又分為顆粒型(particles)和整體化色譜柱(monolithic column)，其中全多孔型填料顆粒(total porous particles)是目前使用最多的液相色譜固定相材料。

　　表面多孔型填料是在無(wú)孔實(shí)心的硅膠核外面生成一個(gè)均勻的多孔外殼。由于顆粒內(nèi)核是實(shí)心的，溶質(zhì)成分在通過(guò)固定相時(shí)，只在顆粒填料表面的多孔成分進(jìn)行吸附和分配，其擴(kuò)散路徑縮短，傳質(zhì)效率提高，只需要花費(fèi)少量的時(shí)間便能擴(kuò)散至硅球表面的顆?？字?，在較短時(shí)間完成擴(kuò)散，更快地傳質(zhì)。與相同粒徑的全多孔型填料相比，其傳質(zhì)速度和柱效得到大大提高。全多孔顆粒填料和核殼型填料的顆粒構(gòu)造如圖1所示。

　　注：近年來(lái)，液相色譜柱技術(shù)發(fā)展的非常迅速，這同時(shí)也促進(jìn)了高效液相色譜法在藥物分析中更為廣泛的應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，一個(gè)典型的制藥企業(yè)甚至可能會(huì)擁有成百上千支液相色譜柱，在一種藥物分析方法的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，如何選擇適當(dāng)?shù)纳V柱往往會(huì)給實(shí)驗(yàn)人員帶來(lái)很多困擾。

　　本文獻(xiàn)原文刊登于《藥物分析雜志》2017年37卷第2期，作者為洪小栩、石瑩、宋雪潔等八人，分別來(lái)自國(guó)家藥典委員會(huì)、揚(yáng)子江藥業(yè)、安捷倫科技和江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院等單位。本文為該文獻(xiàn)的第一部分，詳細(xì)介紹了液相色譜柱及其填料的種類(lèi)。儀器信息網(wǎng)后續(xù)還將發(fā)布該論文其余內(nèi)容，為廣大色譜柱用戶以及色譜柱供應(yīng)商提供相關(guān)參考。