精確檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)的新方法

 CRISPR作為新興的基因組編輯技術(shù)，雖然優(yōu)勢(shì)多多，但是仍然被脫靶效應(yīng)所困擾。CRISPR技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于研究中，而將來更有望用于臨床，但若要轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用，準(zhǔn)確檢測(cè)脫靶效應(yīng)則是必不可少的。近日，麻省總醫(yī)院的研究人員開發(fā)出一種新策略，能夠鑒定全基因組范圍的CRISPR/Cas9脫靶突變。
精確檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)的新方法　　　　之前，在全基因組范圍鑒定脫靶效應(yīng)的細(xì)胞方法也時(shí)有報(bào)道，但這些方法可能錯(cuò)過低頻率的脫靶突變，而且高效轉(zhuǎn)染的要求也限制了其應(yīng)用。相比之下，體外篩查策略則具有一定的優(yōu)勢(shì)。它不需要高效轉(zhuǎn)染，避免了細(xì)胞適應(yīng)性的影響。此外，活性核酸酶的濃度可以盡可能高，將低頻率突變一網(wǎng)打盡。　　　　在這篇周一發(fā)表于《Nature Methods》的文章中，麻省總醫(yī)院和哈佛大學(xué)的研究人員介紹了一種新的體外篩查方法CIRCLE-seq。他們認(rèn)為，這種方法在鑒定全基因組的CRISPR/Cas9脫靶突變上，比現(xiàn)有的細(xì)胞或生化方法表現(xiàn)更佳?！　　　?ldquo;與之前的體外方法相比，我們表明CIRCLE-seq可使用廣泛普及的新一代測(cè)序技術(shù)，且不需要參考基因組序列，”作者在文中寫道。重要的是，這種方法可以鑒定與細(xì)胞類型特異的單核苷酸多態(tài)性相關(guān)的脫靶突變，證明了它有望生成個(gè)性化的特異性圖譜?？傊?，CIRCLE-seq為鑒定全基因組范圍的脫靶突變提供了一種快速全面的方法?！　　　≡谶@項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)了不依賴限制性內(nèi)切酶的策略，將隨機(jī)剪切的DNA轉(zhuǎn)化為兩種不同類型的共價(jià)閉合DNA結(jié)構(gòu)：將莖環(huán)連接到線性DNA末端，或?qū)⒕€性片段環(huán)化。他們發(fā)現(xiàn)，在富集Cas9核酸酶切割的基因組DNA片段時(shí)，環(huán)化策略的效率比連接策略至少高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。　　　　隨后，研究人員檢測(cè)了新方法的靈敏度。他們獲得了針對(duì)HBB基因的向?qū)NA的脫靶結(jié)果，并將這個(gè)圖譜與另一種鑒定方法（Digenome-seq）獲得的圖譜進(jìn)行比較。他們發(fā)現(xiàn)，CIRCLE-seq鑒定出Digenome-seq所發(fā)現(xiàn)的29個(gè)脫靶位點(diǎn)中的26個(gè)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了156個(gè)新位點(diǎn)?！　　　?ldquo;這些結(jié)果表明，與Digenome-seq相比，CIRCLE-seq具有更高的信噪比，且需要的測(cè)序reads少了100倍。在鑒定全基因組的脫靶位點(diǎn)時(shí)，它有望實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度，”作者寫道。　　　　在同一期的雜志上，Caribou Biosciences和DuPont Pioneer的研究人員介紹了另一種名為SITE-Seq的生化方法，它利用通過向?qū)NA編程的Cas9來鑒定基因組內(nèi)的切割位點(diǎn)?！　　　【庉孅c(diǎn)評(píng)　　　　IDLV方法并非完美，因?yàn)樗荒芸煽繖z測(cè)低頻率的脫靶位點(diǎn)，但強(qiáng)調(diào)這種方法的無偏向性。這是一個(gè)生物學(xué)分析；它并非基于哪些可能是脫靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)?！　　　?/span>