哥大閔瑋團隊：電子預(yù)共振受激拉曼散射顯微鏡技術(shù)

  來自美國哥倫比亞大學(xué)的研究人員報道了一種全新的成像技術(shù)：電子預(yù)共振受激拉曼散射顯微鏡(Electronic Pre-Resonance Stimulated Raman Scattering Microscopy)。這一技術(shù)結(jié)合了拉曼散射光譜窄(～1 nm)以及熒光分析靈敏度高的優(yōu)點。研究人員利用這種熒光成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了24種顏色各異的探針，展示了多達16種顏色的活細胞成像和8種顏色的腦組織成像。
　這一研究成果公布在4月19日的Nature雜志上，文章的通訊作者是哥倫比亞大學(xué)化學(xué)系閔瑋教授，閔瑋早年畢業(yè)于北京大學(xué)，2008年在哈佛大學(xué)獲化學(xué)博士學(xué)位，導(dǎo)師為美國科學(xué)院院士謝曉亮教授，之后在其課題組從事博士后研究。閔瑋博士現(xiàn)任哥倫比亞大學(xué)化學(xué)系終身教授，研究成果多次發(fā)表在Nature Method、PNAS等國際學(xué)術(shù)期刊，因其科學(xué)貢獻獲得過很多獎項，其中包括2013年的斯隆研究獎。
  近年來，顯微鏡技術(shù)在不斷地突破自身的局限。2000年以來興起的超分辨熒光成像技術(shù)，已經(jīng)突破了光學(xué)衍射極限。2015年，閔瑋研究組開發(fā)出一種新的方法，即基于受激拉曼散射(SRS)成像，可視化單細胞內(nèi)的葡萄糖攝取活性，并展示了其在肝癌細胞、腫瘤異種移植組織、原代神經(jīng)元及小鼠腦組織中的應(yīng)用。這是亞細胞分辨率的一個突破。

　電子預(yù)共振受激拉曼散射是拉曼散射的一種特殊形式。拉曼散射信號通常很微弱，受激拉曼散射通過兩束滿足共振條件泵浦和斯托克斯激光與分子特定振動發(fā)生特異性耦合來增強信號。受激拉曼散射和生物成像的結(jié)合是由哈佛大學(xué)謝曉亮教授首次在Science雜志報導(dǎo)，閔瑋博士就是其中的主要發(fā)明人，謝曉亮教授曾表示，他想在無熒光標(biāo)記的情況下增加拉曼光譜的靈敏度，甚至來檢測單分子。但是這個項目實在太難了，謝曉亮幾乎無法說服學(xué)生們來嘗試，最終是閔瑋接受了挑戰(zhàn)，他與一位德國的研究生Chris Freudiger取得了突破：通過探測受激拉曼散射信號獲得了無需熒光標(biāo)記的生物醫(yī)學(xué)顯微圖像。

 自此之后，這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用在生命分析研究中。電子共振拉曼散射則是另一種增強拉曼信號的方法：當(dāng)泵浦激光的頻率接近分子的電子能級躍遷頻率(即吸收波長)時，與電子能級躍遷耦合相關(guān)的分子振動光譜也被選擇性增強。因此，將電子共振拉曼散射和受激拉曼散射結(jié)合，可以極大地提升拉曼信號。

  然而當(dāng)泵浦激光頻率嚴(yán)格等于分子的電子能級躍遷頻率時，分子不但會經(jīng)歷電子共振受激拉曼散射，同時也有其他的泵浦-探測過程干擾檢測信號。在這篇文章中，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)泵浦激光頻率略低于分子的電子能級躍遷頻率(實驗發(fā)現(xiàn)與分子吸收峰相差2100波數(shù)左右)時，可以在實現(xiàn)最大的信號增強的同時，避免檢測背景的干擾。
　　
  項技術(shù)就是電子預(yù)共振受激拉曼散射，可以將以前普遍使用的無共振的受激拉曼散射信號提升1000倍左右，1毫秒內(nèi)的對應(yīng)檢出限在250 nM，從而可以勝任大部分生物分子的成像分析。
　　
  之后這一研究組著力于尋找和開發(fā)合適的分子探針。由于選用的泵浦激光器波長在900 nm左右，其對應(yīng)的預(yù)共振拉曼探針吸收波長在650-750 nm時，可以實現(xiàn)最佳的信號提升。這個波長段的商用分子探針，如Alexa647、Atto740等，都在C=C碳碳雙鍵區(qū)間顯示了特征的預(yù)共振拉曼譜。
　　
   研究人員利用5種商用分子探針的預(yù)共振拉曼散射并結(jié)合3種熒光探針，實現(xiàn)了8種顏色的活細胞成像。為了進一步克服碳碳雙鍵區(qū)間波段非常擁擠的缺點，他們創(chuàng)新地發(fā)明和發(fā)展了一系列含有炔基(碳碳三鍵)和氰基(碳氮三鍵)的分子探針。由于炔基和氰基的拉曼振動在無干擾的2000-2300 cm-1區(qū)間有單一的特征頻率，且與生物體內(nèi)常見基團有顯著區(qū)別，該區(qū)間的拉曼探針可以比在擁擠的“指紋區(qū)”實現(xiàn)更多的“顏色”。研究人員結(jié)合了同位素標(biāo)記和結(jié)構(gòu)修飾等策略，合成了28種吸收在650-750 nm、三鍵振動頻率在2000-2300 cm-1的新型預(yù)共振拉曼探針，并為他們?nèi)∶麨镸anhattan Raman Scattering(MARS)調(diào)色板。
  研究人員還通過神經(jīng)細胞和大腦切片的成像，展示了預(yù)共振受激拉曼散射顯微鏡及其相應(yīng)探針技術(shù)在生命科學(xué)研究中的潛力。
　　
  他們對小鼠海馬體神經(jīng)細胞進行了體外培養(yǎng)，并用免疫標(biāo)記的方法標(biāo)記了5種不同的標(biāo)志蛋白，用兩種正交的代謝標(biāo)記對細胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)進行脈沖-追蹤實驗，并用DNA染料確定細胞核的位置。通過對8種“顏色”的細胞圖像進行交叉對比分析，研究人員觀察到新生成的包涵體主要是由新合成的蛋白質(zhì)構(gòu)成。而星形膠質(zhì)細胞中的內(nèi)涵體遠多于神經(jīng)元細胞。他們認(rèn)為這個實驗支持了一個假說：星形膠質(zhì)細胞可以將新合成的折疊錯誤的蛋白質(zhì)隔離進入包涵體來減弱他們的毒性，然而神經(jīng)元細胞沒有這種能力，因此對蛋白質(zhì)調(diào)控的錯亂更加沒有耐受性。
  除此之外，閔瑋研究組還開發(fā)了一種通用方法，可成像如小分子藥物和核酸、氨基酸、脂類等廣譜生物小分子，確定它們的定位以及在細胞內(nèi)的功能機制。
  當(dāng)涉及到生物小分子時，熒光標(biāo)記則存在問題，因為熒光團幾乎總是大于目的小分子或是與目的小分子差不多大小。因此，它們往往會破壞這些發(fā)揮重要生物作用的小分子的正常功能。閔瑋研究組放棄常規(guī)的熒光團熒光成像范式，轉(zhuǎn)而追尋一種新型的物理和化學(xué)組合。具體說來，他們將一種稱作為受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering, SRS)顯微鏡的新興激光技術(shù)，與一種小型但非常有活力的炔烴標(biāo)記(即C≡C，碳碳三鍵)相結(jié)合，C = C是一種化合物鍵，當(dāng)其拉伸時，會以獨特的“頻率”(不同于細胞內(nèi)的自然分子)發(fā)出強烈的拉曼散射信號。
  采用這一小型的炔烴標(biāo)記，這一新技術(shù)避免了采用更大熒光標(biāo)記物造成的干擾，同時通過SRS成像獲得了高檢測特異性和靈敏度。通過將激光顏色調(diào)整至炔烴頻率，并快速用聚焦激光光束逐點掃過樣本，SRS顯微鏡可捕獲小分子攜帶的C≡C鍵的獨特拉伸運動，生成活細胞和動物體內(nèi)分子的三維圖像。以這種方式，閔瑋研究小組證實可以追蹤小鼠組織中帶有炔烴的藥物，以及顯影通過在活細胞中代謝納入炔烴標(biāo)記的前體小分子重新合成的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂和甘油三酯。
　閔瑋接受挑戰(zhàn)，他與一位德國的研究生Chris Freudiger取得了突破：通過探測受激拉曼散射信號獲得了無需熒光標(biāo)記的生物醫(yī)學(xué)顯微圖像。新顯微術(shù)突破傳統(tǒng)光學(xué)成像顏色極限，　自此之后，這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用在生命分析研究中。因此，將電子共振拉曼散射和受激拉曼散射結(jié)合，可以極大地提升拉曼信號。