科學(xué)家在手持式PCR儀技術(shù)取得最新突破

   聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外擴(kuò)增特定 DNA 片段的技術(shù)，由諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主 Kary Mullis 于上世紀(jì) 80 年代發(fā)明，被譽(yù)為分子生物學(xué)領(lǐng)域的最重大進(jìn)步之一，廣泛應(yīng)用于分子和遺傳學(xué)分析。
  30 年以來，科學(xué)家們一直在試圖優(yōu)化 PCR 技術(shù)，并擴(kuò)大它的用途?，F(xiàn)在，來自于范德堡大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)提出一種新方法——“適應(yīng)性 PCR”(adaptive PCR)，有望革新傳統(tǒng)的 PCR 技術(shù)，并為 “手持式 PCR 儀” 帶來可能。相關(guān)研究成果以 “Adaptive PCR Based on Hybridization Sensing of Mirror-Image L-DNA” 為題發(fā)表在《Analytical Chemistry》期刊。
 　PCR 的反應(yīng)過程包含 3 個(gè)基本步驟，依次為：變性(高溫環(huán)境下模板 DNA 發(fā)生變性，由雙鏈變成單鏈)、退火(低溫環(huán)境下引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合)、延伸(溫度回升至最適宜后，DNA 聚合酶開始合成互補(bǔ)鏈)。至此獲得兩條精確復(fù)制地 DNA 雙鏈。隨后，PCR 反應(yīng)將進(jìn)入 “變性—退火—延伸” 的循環(huán)，獲得更多的半保留復(fù)制鏈，30-40 個(gè)循環(huán)可以獲得幾百萬倍的基因數(shù)量。
 　由此可見，溫度和樣本是實(shí)現(xiàn) PCR 的關(guān)鍵因素?；诰酆厦钢圃斓?PCR 儀實(shí)際上是一個(gè)溫控設(shè)備，需要控制變性、復(fù)性和延伸的溫度。室溫的變化、樣本化學(xué)成分的改變都會(huì)影響 PCR 反應(yīng)。所以，實(shí)驗(yàn)人員可能需要經(jīng)過多次試驗(yàn)優(yōu)化出最佳的樣本配比、最高效的溫度設(shè)置。
 　盡管技術(shù)成熟，PCR 儀器卻操作復(fù)雜且對(duì)樣本的化學(xué)成分及反應(yīng)環(huán)境高度敏感，這主要是因?yàn)闆]有最直接的方法從分子水平監(jiān)控反應(yīng)過程。
 　為了實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制，范德堡大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)工程師 Nicholas Adams 和 Frederick Haselton 將 “開箱即用” 的理念應(yīng)用于 PCR，并提出“適應(yīng)性 PCR”(adaptive PCR)的新方法。他們利用左旋 DNA(L-DNA)監(jiān)測(cè)、控制 PCR 反應(yīng)。
 　左旋 DNA 是 DNA 分子的鏡像，其物理特性與右旋 DNA 一樣，但是它不參與大多數(shù)生物反應(yīng)。因此，當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的左旋 DNA 被添加至 PCR 樣本中，它會(huì)以相同的方式(變性、退火)提供熒光信號(hào)反映分子反應(yīng)信息、
 　為了驗(yàn)證他們的設(shè)想，Adams 和 Haselton 聯(lián)合物理系助理教授 William Gabella 一起創(chuàng)建了一個(gè)適應(yīng)性 PCR 設(shè)備原型(如下圖)，并進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)。
 　手持式 PCR 儀：左邊是紫外激光器，由它照射中間的樣本，右邊的分光光度計(jì)負(fù)責(zé)檢測(cè)樣本中熒光水平的變化，從而控制 DNA 復(fù)制過程。
 　Adams 表示：“現(xiàn)有的 PCR 儀器非常挑剔。我們實(shí)驗(yàn)室配備有 3 臺(tái) PCR 儀。當(dāng)我們將相同的樣本放入 3 臺(tái)儀器中，只有兩臺(tái)儀器正常工作。當(dāng)我與儀器公司的技術(shù)人員反映這一問題時(shí)，她詢問我儀器周圍是否有八英尺厚的墻壁？我回復(fù)說是的。她解釋是因?yàn)檫@堵墻干擾了氣流，從而對(duì)儀器運(yùn)行造成影響。當(dāng)然，事實(shí)證明她是對(duì)的，因?yàn)楫?dāng)我把儀器移出來，它又開始正常工作了!”
 　技術(shù)人員對(duì)一系列可能的問題提出應(yīng)對(duì)之策：儀器需放置在溫度可控的房間；DNA 樣本需要純化…… 即便如此，它仍然需要實(shí)驗(yàn)人員耗費(fèi)時(shí)間優(yōu)化反應(yīng)條件。
 　現(xiàn)在，適應(yīng)性方法能夠控制 PCR 過程，有望簡化操作、提高準(zhǔn)確性、降低其對(duì)環(huán)境的敏感性，減少儀器大小(從臺(tái)式到手持)。
 　適應(yīng)性 PCR 借助熒光標(biāo)記的左旋 DNA 確定理想的變性和退火溫度，從而規(guī)避了所有變量。
 　左旋 DNA 序列可以通過商業(yè)合成獲得，其序列與需要擴(kuò)增的 DNA 序列一樣，而且左旋 DNA 的兩條鏈上分別標(biāo)記上一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)(當(dāng)兩條鏈完整時(shí)，淬滅基團(tuán)會(huì)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào))。
 　伴隨著高溫環(huán)境，左旋 DNA 也會(huì)發(fā)生變性變成單鏈，使得熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。通過分析熒光信號(hào)的累積速度，研究人員可以確定所有雙鏈分離的精確時(shí)間點(diǎn)。
 　同時(shí)，我們還需要合成左旋引物(標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán))。當(dāng) PCR 反應(yīng)進(jìn)行至退火步驟，引物會(huì)與左旋 DNA 單鏈集合，其淬滅基團(tuán)會(huì)抑制熒光信號(hào)。這時(shí)候，熒光信號(hào)又會(huì)發(fā)生變化，從而便于研究人員分析引物與所有 DNA 單鏈結(jié)合的時(shí)間點(diǎn)。
 　值得注意的是，左旋 DNA 的量并不會(huì)改變，因?yàn)樗粎⑴c擴(kuò)增步驟。
 　研究人員表示，這一適應(yīng)性 PCR 技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng) PCR 儀器的局限性，它可以讓基于 PCR 的診斷有機(jī)會(huì)脫離實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，例如樣本制備的高標(biāo)準(zhǔn)、反應(yīng)溫度的嚴(yán)密控制。