分子生物學技術對核酸擴增反應進行高靈敏度檢測

   聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。
　PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

　數(shù)字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。
　20 世紀末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元至多包含一個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析。
　數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實時熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR是最新的定量技術，基于單分子PCR方法來進行計數(shù)的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
　數(shù)字PCR技術不斷發(fā)展，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等廠家相繼推出技術較為成熟的數(shù)字PCR產品。
　利用與核苷酸加入相關的pH變化對核酸擴增反應進行電學檢測能夠使得測試裝置小型化和具有更大的可移植性，并且降低成本。然而，當前的檢測核酸擴增反應的離子敏感場效應晶體管（ion-sensitive field effect transistor, ISFET）方法依賴于在一種體積龐大的難以精密加工的參考電極上建立流體門控電勢，然而因其難以精密加工也就限制了進行大規(guī)模平行反應檢測的潛力。
　在一項新的研究中，來自美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校的研究人員展示了利用一種將pH不敏感性參考場效應晶體管（reference field effect transistor, REFET）與微加工固態(tài)準參考電極（quasi-reference electrode, QRE）相配套使用的方法能夠檢測實時的pH變化。最終的結果是研究人員開發(fā)出一種0.18μm的絕緣體硅片鑄造的傳感器，這種傳感器利用鉑QRE建立一種pH敏感的流體門控電勢，并且利用一種聚氯乙烯（PVC）膜REFET能夠基于pH變化對環(huán)介導等溫擴增（LAMP）進行檢測。這種技術非常適合進行商業(yè)化擴大生產，降低對ISFET pH檢測的包裝和制造需求，而且能夠大規(guī)模地進行平行液滴測量，如監(jiān)測數(shù)字PCR中的反應進程。
　研究人員詳細了闡明了一種實現(xiàn)這種目標的方法所需的所有步驟。鑒于固態(tài)電極的pH敏感性，REFET設計已被人們使用。一種攜帶pH不敏感性膜的ISFET可用來監(jiān)控這種電極的pH反應。之前的技術已展示了在ISFET上使用pH不敏感性層，如硅烷、緩沖水凝膠、聚對二甲苯和polyACE。然而，PVC提供一種有吸引力的替代性選擇，這是因為它之前已被證實的簡單制造過程、良好的pH不敏感性和已知的與加有BSA的PCR的兼容性。總之，將一種pH敏感性電極與一種pH不敏感性REFET結合在一起的系統(tǒng)為在芯片上對生物反應（如靶向檢測多種病原體的LAMP）進行電學檢測提供一種機會。
　總之，在這項新的研究中，研究人員開發(fā)出一種對核酸擴增反應進行電學檢測的新技術。將一種場效應晶體管與一種固態(tài)電極進行結合會簡化對大規(guī)模LAMP等生物反應進行ISFET pH檢測。通過將易于制造的固態(tài)微電極整合在一種芯片的表面上，就能夠單個地對液滴進行測量，并且繪制出它們發(fā)生變化的性質。可能從這種方法獲得巨大益處的技術包括數(shù)字PCR或數(shù)字LAMP，以及基于介質上電潤濕的液滴操縱而能夠開展的檢測方法。人們可能利用這種方法開展酶活性高通量分析，檢測靶核酸序列是否存在，或者通過酶反應速率檢測靶生物分子是否存在等。這種方法能夠通過使用常見的金屬鍍膜技術和一種pH不敏感性的REFET進行液滴測量和簡化大規(guī)模液體測量。