高通量基因組測(cè)序等三項(xiàng)革命性技術(shù)服務(wù)于醫(yī)療領(lǐng)域勢(shì)不可擋！

  隨著人們探索和操控基因組技術(shù)的進(jìn)步，生物醫(yī)學(xué)也迎來(lái)了前所未有的發(fā)展機(jī)遇。在過(guò)去，人們形容新事物發(fā)展速度喜好用“火箭”般，而如今測(cè)序技術(shù)的推進(jìn)，醫(yī)療技術(shù)也正以“基因”數(shù)據(jù)的遞增速度而快速進(jìn)步。

  安永預(yù)測(cè)的2020年醫(yī)療服務(wù)模式

 美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Laboratory)建立于1929年，是一個(gè)非贏利性的獨(dú)立研究機(jī)構(gòu)。80多年以來(lái)，杰克遜實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家們一直從事基于小鼠的生物醫(yī)學(xué)研究，并在小鼠的繁育、小鼠遺傳學(xué)和在研究中如何選擇運(yùn)用實(shí)驗(yàn)小鼠方面積累了大量的寶貴知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。

  作為世界最大的遺傳基因工程研究中心，杰克遜實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為：有三項(xiàng)技術(shù)正在勢(shì)不可擋地服務(wù)于制藥和醫(yī)療領(lǐng)域，依次是：高通量基因組測(cè)序，CRISPR基因編輯和單細(xì)胞基因組學(xué)。借助于上述技術(shù)，科學(xué)家們逐漸揭開了蘊(yùn)藏于人體的DNA的奧秘，并試圖溯源復(fù)雜疾病的本質(zhì)。本文主要從它們?nèi)绾纬霈F(xiàn)?如何工作?以及如何改變生物醫(yī)學(xué)進(jìn)程三個(gè)方面來(lái)闡述這3大技術(shù)。

  高通量基因組測(cè)序

  如何出現(xiàn)?

  人體的基因有30億個(gè)堿基對(duì)，由堿基對(duì)排列差異造成了人與人之間的差異。為了發(fā)現(xiàn)這些差異，科學(xué)家發(fā)明了儀器來(lái)讀取A、G、C、T的意義。尤其是高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序。

  2005年，454公司首先推出了二代測(cè)序儀;2006年，Solexa推出了Genome Analyzer;2007年年初Illumina收購(gòu)了Solexa公司，在隨后的幾年陸續(xù)推出了Hiseq、MiSeq、NextSeq等多種系列測(cè)序儀;ABI推出了SOLiD測(cè)序平臺(tái)，隨后收購(gòu)了454測(cè)序儀發(fā)明者創(chuàng)立的Ion Torrent，轉(zhuǎn)而大力推廣PGM和Ion Proton平臺(tái);2014年，也就是高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展的第十年，Illumina公司的Hiseq X平臺(tái)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了1000美金一個(gè)人類基因組測(cè)序的目標(biāo)。2015年，華大子公司CG推出新款“超級(jí)測(cè)序儀”Revolocity?，該系統(tǒng)結(jié)合了Complete Genomics新一代測(cè)序技術(shù)和操作經(jīng)驗(yàn)，可以對(duì)人全血、唾液等各種樣本進(jìn)行自動(dòng)化的DNA提取。

  如何工作?

  高通量基因組測(cè)序主要包括樣本準(zhǔn)備(sample fragmentation)、文庫(kù)構(gòu)建(library preparation)、測(cè)序反應(yīng)(sequencing reaction)、數(shù)據(jù)分析(data analysis)。由于具體操作已經(jīng)是人盡皆知，在此不贅述。

  如何改變生物醫(yī)學(xué)進(jìn)程?

 高通量測(cè)序(NGS)從興起到現(xiàn)在已有10余年的時(shí)間，但其成本下降依舊只是這幾年的事情。隨著成本的不斷下降，高通量DNA測(cè)序平臺(tái)已經(jīng)發(fā)展為基因組和各種基因文庫(kù)序列檢測(cè)的強(qiáng)大工具。大容量的抗體基因庫(kù)是目前獲得抗體新藥的基礎(chǔ)，高通量DNA測(cè)序技術(shù)為從海量的抗體基因庫(kù)中快速發(fā)現(xiàn)功能抗體分子提供了可能。

 NIH統(tǒng)計(jì)的讀取DNA序列成本

  1000美金價(jià)格的實(shí)現(xiàn)比十年前的30億美金降低了300萬(wàn)倍。除此以外，還有一些公司開發(fā)了第三代測(cè)序儀，比如Pacific Biosciences的PacBio RS測(cè)序儀，DNA模板無(wú)需二代測(cè)序常用的PCR擴(kuò)增的方法，就可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)讀長(zhǎng)、實(shí)時(shí)的測(cè)序;Oxford Nanopore MinION測(cè)序儀只有USB存儲(chǔ)器那么大等等。

  NIH統(tǒng)計(jì)的基因組測(cè)序價(jià)格

  隨著高通量測(cè)序的普及，全基因組測(cè)序?qū)⒃絹?lái)越普遍(花更少的時(shí)間和金錢)，基于NGS平臺(tái)展開的各類醫(yī)療服務(wù)，猶如基于ios系統(tǒng)的APP，在一個(gè)較小的平臺(tái)上，可以按需使用相關(guān)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行測(cè)序。

  CRISPR基因編輯

  如何出現(xiàn)?

  在細(xì)菌的基因末端，一段 DNA序列會(huì)緊接著一段它自己的反向序列，然后再接一段大約30bp左右的、貌似是由堿基隨機(jī)排列而成的DNA序列，科學(xué)家們?cè)Q之為“空格DNA(spacer DNA)”，由于在大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌(archaea)中都能夠觀察到這種現(xiàn)象，于是科學(xué)家們給這種序列取了一個(gè)名字——成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，簡(jiǎn)而言之CRISPR。如今，CRISPR熱度已趕超上世紀(jì)末開始大放光彩的簡(jiǎn)稱PCR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)。

  如何工作?

  CRISPR/Cas9技術(shù)的產(chǎn)生與DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步密不可分。CRISPR由兩部分組成：一部分是可以切割基因的“手術(shù)刀”蛋白Cas9;另一部分是拖著“手術(shù)刀”在基因組的“茫茫大海”中精確定位的向?qū)NA(Guide RNA)。一些科學(xué)家用滅活版本的Cas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合，改造出只有精確定位功能的CRISPR技術(shù)，可用來(lái)關(guān)閉或打開幾乎任何單個(gè)基因，或者精細(xì)地調(diào)控它們的活躍程度，這被視為令人激動(dòng)的一個(gè)研究方向。

  如何改變生物醫(yī)學(xué)進(jìn)程?

  幾千年來(lái)，人類一直在改造大自然?，F(xiàn)在，有了被譽(yù)為“基因剪刀”的CRISPR基因組編輯技術(shù)，人類有望以前所未有的能力改造自身。CRISPR技術(shù)問(wèn)世僅3年，就已被全世界生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和制藥企業(yè)廣泛應(yīng)用。

  首先，通過(guò)CRISPR方法構(gòu)建一種小鼠動(dòng)物病理模型僅需數(shù)周，遠(yuǎn)低于過(guò)去的近1年時(shí)間，并能以更快的速度對(duì)基因進(jìn)行研究，同時(shí)可以一次對(duì)細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)基因進(jìn)行遺傳學(xué)改造，研究這些基因之間的相互作用;其次，通過(guò)CRISPR技術(shù)成功打造“基因驅(qū)動(dòng)”系統(tǒng)，并被用于根除瘧疾、登革熱等蟲媒疾病、消滅或控制入侵物種等;第三，哈佛大學(xué)研究人員利用CRISPR技術(shù)一次性敲除豬細(xì)胞中62個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因，從而掃清豬器官用于人體移植的重大難關(guān)，給異種器官移植工作帶來(lái)了曙光，為全世界需要器官移植的上百萬(wàn)病人帶來(lái)希望;第四，中山大學(xué)黃軍就利用CRISPR技術(shù)成功修改人類胚胎基因，或可用于治療地中海貧血等疾病。

  科學(xué)家們夢(mèng)想能操縱基因，CRISPR如今讓它成為現(xiàn)實(shí)，它的能力令人極其興奮?？蒲腥藛T相信，在CRISPR的推動(dòng)下，一場(chǎng)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的革命正在到來(lái)。無(wú)論好壞，我們正翱翔在CRISPR的世界里。

 單細(xì)胞測(cè)序是一個(gè)新興的領(lǐng)域

  如何出現(xiàn)?

  細(xì)胞是生物學(xué)的基本單位，人體大約由200種不同類型近40兆(trillion)個(gè)細(xì)胞組成。在這種顯著的多樣性中，科學(xué)家們通常都是在大批量地探索細(xì)胞，曾發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞一次分析的辦法，不過(guò)這反映的是人體的整個(gè)細(xì)胞，而不是單個(gè)特定細(xì)胞狀況。出現(xiàn)這種狀況的原因是從單個(gè)細(xì)胞中提取的DNA(RNA/蛋白)不足以進(jìn)行基因組規(guī)模的研究。

  捕獲單個(gè)細(xì)胞和泡沫分離的液體，并準(zhǔn)備進(jìn)行分析

  單細(xì)胞測(cè)序指DNA研究中涉及測(cè)序單細(xì)胞微生物相對(duì)簡(jiǎn)單的基因組，更大更復(fù)雜的人類細(xì)胞基因組，是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)。盡管早在1990年，Norman Iscove的課題組就通過(guò)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)cDNA分子的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，證實(shí)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析是可行的 ;但單細(xì)胞測(cè)序萌芽于2010年，2013年左右才真正發(fā)展起來(lái);2014年，單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用被列為Nature Methods年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展;2015基因組學(xué)前沿研討會(huì)將單細(xì)胞組學(xué)單獨(dú)列為一個(gè)單元。

  如何工作?

 單細(xì)胞測(cè)序的工作流

  單細(xì)胞測(cè)序分為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞基因組測(cè)序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分為：?jiǎn)渭?xì)胞DGE、單細(xì)胞polyA測(cè)序、單細(xì)胞lncRNA測(cè)序;單細(xì)胞基因組測(cè)序分為：?jiǎn)渭?xì)胞外顯子組測(cè)序和單細(xì)胞全基因組重測(cè)序。

  單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用主要包括癌癥領(lǐng)域和生殖領(lǐng)域的應(yīng)用。譬如華大基因用解析單細(xì)胞基因組研究原發(fā)性血小板增多癥(一種血癌)和腎透明細(xì)胞癌(一種腎癌)的腫瘤內(nèi)部遺傳特征;MD安德森癌癥中心的遺傳學(xué)家通過(guò)單細(xì)胞分辨率乳腺癌遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞通常包含數(shù)十個(gè)罕見突變，而這些突變采用大型腫瘤測(cè)序方法通常無(wú)法檢測(cè)到;Smart-Seq的基因組測(cè)序方法可以深入分析臨床相關(guān)的單細(xì)胞;謝曉亮團(tuán)隊(duì)通過(guò)MALBAC進(jìn)行單基因遺傳病和染色體異常同時(shí)篩查助力孕婦誕生了試管嬰兒。

  總之，利用單細(xì)胞基因組學(xué)，研究人員可以逆向操控發(fā)育過(guò)程，揭示出了單個(gè)的前體細(xì)胞類型是如何生成這兩種不同的成熟肺泡細(xì)胞的。在個(gè)別細(xì)胞之間的遺傳差異表達(dá)方面擁有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)，為癌癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。杰克遜實(shí)驗(yàn)室單細(xì)胞基因組學(xué)研究室主任Paul Robson在一份聲明中表示，目前單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)正在快速發(fā)展，而增加專門從事研究領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)室或?qū)楦嗟纳飳W(xué)家提供最好的可用工具來(lái)進(jìn)行基因組學(xué)研究;單細(xì)胞基因組學(xué)研究中心的成立或?qū)楦嗟穆?lián)合研究提供更多機(jī)會(huì)。