高通量基因組測序等三項革命性技術(shù)服務(wù)于醫(yī)療領(lǐng)域勢不可擋！

  隨著人們探索和操控基因組技術(shù)的進步，生物醫(yī)學也迎來了前所未有的發(fā)展機遇。在過去，人們形容新事物發(fā)展速度喜好用“火箭”般，而如今測序技術(shù)的推進，醫(yī)療技術(shù)也正以“基因”數(shù)據(jù)的遞增速度而快速進步。

  安永預測的2020年醫(yī)療服務(wù)模式

 美國杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory)建立于1929年，是一個非贏利性的獨立研究機構(gòu)。80多年以來，杰克遜實驗室的科學家們一直從事基于小鼠的生物醫(yī)學研究，并在小鼠的繁育、小鼠遺傳學和在研究中如何選擇運用實驗小鼠方面積累了大量的寶貴知識和經(jīng)驗。

  作為世界最大的遺傳基因工程研究中心，杰克遜實驗室認為：有三項技術(shù)正在勢不可擋地服務(wù)于制藥和醫(yī)療領(lǐng)域，依次是：高通量基因組測序，CRISPR基因編輯和單細胞基因組學。借助于上述技術(shù)，科學家們逐漸揭開了蘊藏于人體的DNA的奧秘，并試圖溯源復雜疾病的本質(zhì)。本文主要從它們?nèi)绾纬霈F(xiàn)?如何工作?以及如何改變生物醫(yī)學進程三個方面來闡述這3大技術(shù)。

  高通量基因組測序

  如何出現(xiàn)?

  人體的基因有30億個堿基對，由堿基對排列差異造成了人與人之間的差異。為了發(fā)現(xiàn)這些差異，科學家發(fā)明了儀器來讀取A、G、C、T的意義。尤其是高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。

  2005年，454公司首先推出了二代測序儀;2006年，Solexa推出了Genome Analyzer;2007年年初Illumina收購了Solexa公司，在隨后的幾年陸續(xù)推出了Hiseq、MiSeq、NextSeq等多種系列測序儀;ABI推出了SOLiD測序平臺，隨后收購了454測序儀發(fā)明者創(chuàng)立的Ion Torrent，轉(zhuǎn)而大力推廣PGM和Ion Proton平臺;2014年，也就是高通量測序技術(shù)發(fā)展的第十年，Illumina公司的Hiseq X平臺已經(jīng)實現(xiàn)了1000美金一個人類基因組測序的目標。2015年，華大子公司CG推出新款“超級測序儀”Revolocity?，該系統(tǒng)結(jié)合了Complete Genomics新一代測序技術(shù)和操作經(jīng)驗，可以對人全血、唾液等各種樣本進行自動化的DNA提取。

  如何工作?

  高通量基因組測序主要包括樣本準備(sample fragmentation)、文庫構(gòu)建(library preparation)、測序反應(yīng)(sequencing reaction)、數(shù)據(jù)分析(data analysis)。由于具體操作已經(jīng)是人盡皆知，在此不贅述。

  如何改變生物醫(yī)學進程?

 高通量測序(NGS)從興起到現(xiàn)在已有10余年的時間，但其成本下降依舊只是這幾年的事情。隨著成本的不斷下降，高通量DNA測序平臺已經(jīng)發(fā)展為基因組和各種基因文庫序列檢測的強大工具。大容量的抗體基因庫是目前獲得抗體新藥的基礎(chǔ)，高通量DNA測序技術(shù)為從海量的抗體基因庫中快速發(fā)現(xiàn)功能抗體分子提供了可能。

 NIH統(tǒng)計的讀取DNA序列成本

  1000美金價格的實現(xiàn)比十年前的30億美金降低了300萬倍。除此以外，還有一些公司開發(fā)了第三代測序儀，比如Pacific Biosciences的PacBio RS測序儀，DNA模板無需二代測序常用的PCR擴增的方法，就可以實現(xiàn)長讀長、實時的測序;Oxford Nanopore MinION測序儀只有USB存儲器那么大等等。

  NIH統(tǒng)計的基因組測序價格

  隨著高通量測序的普及，全基因組測序?qū)⒃絹碓狡毡?花更少的時間和金錢)，基于NGS平臺展開的各類醫(yī)療服務(wù)，猶如基于ios系統(tǒng)的APP，在一個較小的平臺上，可以按需使用相關(guān)的檢測，實現(xiàn)大規(guī)模并行測序。

  CRISPR基因編輯

  如何出現(xiàn)?

  在細菌的基因末端，一段 DNA序列會緊接著一段它自己的反向序列，然后再接一段大約30bp左右的、貌似是由堿基隨機排列而成的DNA序列，科學家們曾稱之為“空格DNA(spacer DNA)”，由于在大約40%的細菌和90%的古細菌(archaea)中都能夠觀察到這種現(xiàn)象，于是科學家們給這種序列取了一個名字——成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，簡而言之CRISPR。如今，CRISPR熱度已趕超上世紀末開始大放光彩的簡稱PCR的聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)。

  如何工作?

  CRISPR/Cas9技術(shù)的產(chǎn)生與DNA測序技術(shù)的進步密不可分。CRISPR由兩部分組成：一部分是可以切割基因的“手術(shù)刀”蛋白Cas9;另一部分是拖著“手術(shù)刀”在基因組的“茫茫大海”中精確定位的向?qū)NA(Guide RNA)。一些科學家用滅活版本的Cas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合，改造出只有精確定位功能的CRISPR技術(shù)，可用來關(guān)閉或打開幾乎任何單個基因，或者精細地調(diào)控它們的活躍程度，這被視為令人激動的一個研究方向。

  如何改變生物醫(yī)學進程?

  幾千年來，人類一直在改造大自然?，F(xiàn)在，有了被譽為“基因剪刀”的CRISPR基因組編輯技術(shù)，人類有望以前所未有的能力改造自身。CRISPR技術(shù)問世僅3年，就已被全世界生物醫(yī)學實驗室和制藥企業(yè)廣泛應(yīng)用。

  首先，通過CRISPR方法構(gòu)建一種小鼠動物病理模型僅需數(shù)周，遠低于過去的近1年時間，并能以更快的速度對基因進行研究，同時可以一次對細胞內(nèi)的多個基因進行遺傳學改造，研究這些基因之間的相互作用;其次，通過CRISPR技術(shù)成功打造“基因驅(qū)動”系統(tǒng)，并被用于根除瘧疾、登革熱等蟲媒疾病、消滅或控制入侵物種等;第三，哈佛大學研究人員利用CRISPR技術(shù)一次性敲除豬細胞中62個逆轉(zhuǎn)錄病毒基因，從而掃清豬器官用于人體移植的重大難關(guān)，給異種器官移植工作帶來了曙光，為全世界需要器官移植的上百萬病人帶來希望;第四，中山大學黃軍就利用CRISPR技術(shù)成功修改人類胚胎基因，或可用于治療地中海貧血等疾病。

  科學家們夢想能操縱基因，CRISPR如今讓它成為現(xiàn)實，它的能力令人極其興奮?？蒲腥藛T相信，在CRISPR的推動下，一場生物醫(yī)學領(lǐng)域的革命正在到來。無論好壞，我們正翱翔在CRISPR的世界里。

 單細胞測序是一個新興的領(lǐng)域

  如何出現(xiàn)?

  細胞是生物學的基本單位，人體大約由200種不同類型近40兆(trillion)個細胞組成。在這種顯著的多樣性中，科學家們通常都是在大批量地探索細胞，曾發(fā)現(xiàn)了一種對成千上萬個細胞一次分析的辦法，不過這反映的是人體的整個細胞，而不是單個特定細胞狀況。出現(xiàn)這種狀況的原因是從單個細胞中提取的DNA(RNA/蛋白)不足以進行基因組規(guī)模的研究。

  捕獲單個細胞和泡沫分離的液體，并準備進行分析

  單細胞測序指DNA研究中涉及測序單細胞微生物相對簡單的基因組，更大更復雜的人類細胞基因組，是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術(shù)。盡管早在1990年，Norman Iscove的課題組就通過PCR技術(shù)實現(xiàn)了對cDNA分子的指數(shù)級擴增，證實對單細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析是可行的 ;但單細胞測序萌芽于2010年，2013年左右才真正發(fā)展起來;2014年，單細胞測序的應(yīng)用被列為Nature Methods年度最重要的方法學進展;2015基因組學前沿研討會將單細胞組學單獨列為一個單元。

  如何工作?

 單細胞測序的工作流

  單細胞測序分為單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和單細胞基因組測序。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分為：單細胞DGE、單細胞polyA測序、單細胞lncRNA測序;單細胞基因組測序分為：單細胞外顯子組測序和單細胞全基因組重測序。

  單細胞測序技術(shù)在臨床醫(yī)學上的應(yīng)用主要包括癌癥領(lǐng)域和生殖領(lǐng)域的應(yīng)用。譬如華大基因用解析單細胞基因組研究原發(fā)性血小板增多癥(一種血癌)和腎透明細胞癌(一種腎癌)的腫瘤內(nèi)部遺傳特征;MD安德森癌癥中心的遺傳學家通過單細胞分辨率乳腺癌遺傳學發(fā)現(xiàn)單個細胞通常包含數(shù)十個罕見突變，而這些突變采用大型腫瘤測序方法通常無法檢測到;Smart-Seq的基因組測序方法可以深入分析臨床相關(guān)的單細胞;謝曉亮團隊通過MALBAC進行單基因遺傳病和染色體異常同時篩查助力孕婦誕生了試管嬰兒。

  總之，利用單細胞基因組學，研究人員可以逆向操控發(fā)育過程，揭示出了單個的前體細胞類型是如何生成這兩種不同的成熟肺泡細胞的。在個別細胞之間的遺傳差異表達方面擁有無與倫比的優(yōu)勢，為癌癥發(fā)生、發(fā)展機制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。杰克遜實驗室單細胞基因組學研究室主任Paul Robson在一份聲明中表示，目前單細胞基因組學技術(shù)正在快速發(fā)展，而增加專門從事研究領(lǐng)域的實驗室或?qū)楦嗟纳飳W家提供最好的可用工具來進行基因組學研究;單細胞基因組學研究中心的成立或?qū)楦嗟穆?lián)合研究提供更多機會。