南海海洋所揭示L-別異亮氨酸的生物合成機(jī)制

　　近日，中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所研究員鞠建華團(tuán)隊(duì)在J. Am. Chem. Soc.（2016, 138 (1), 408-415）發(fā)表文章首次闡述天然產(chǎn)物中L-allo-Ile結(jié)構(gòu)單元的生物合成機(jī)制，論文被同期JACS Spotlights (2016, 138, 461) 作為研究亮點(diǎn)評(píng)述。該成果為研究其它生物體中L-allo-Ile的來(lái)源和生物醫(yī)療提供了思路；“氨基轉(zhuǎn)移酶”和異構(gòu)酶組成的酶對(duì)還可以作為遺傳標(biāo)記，指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)（通過(guò)基因挖掘手段）自然界中含L-allo-Ile結(jié)構(gòu)單元的新穎天然產(chǎn)物用于藥物開(kāi)發(fā)。

　　異亮氨酸（Ile）具有兩個(gè)手性中心，存在4種立體異構(gòu)體：（2S,3S）L-異亮氨酸（l-Ile）、（2R,3R）d-異亮氨酸（d -Ile）、（2S,3R）L-別異亮氨酸（L-allo-Ile）和（2R,3S）d-別異亮氨酸（d-allo-Ile）。L-allo-Ile在自然界不同生物體中廣泛存在，包括微生物天然產(chǎn)物、植物和人體血漿中。在健康人群的血漿中，L-allo-Ile處于幾乎被檢測(cè)不到的濃度水平；但在患有罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病——楓糖尿癥（maple syrup urine disease）患者的血漿和尿液中，L-allo-Ile卻因?yàn)榛颊叩膶?duì)異亮氨酸和其它支鏈氨基酸的代謝缺陷而得到累積，濃度達(dá)到5μM以上。因此，L-allo-Ile在血漿中的濃度水平已經(jīng)作為診斷楓糖尿癥的重要指標(biāo)之一。但L-別異亮氨酸自50多年前被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其生物合成機(jī)制尚不清楚。

　　研究人員從來(lái)源于我國(guó)南海深海的鏈霉菌發(fā)酵液中分離到抗感染環(huán)肽類(lèi)抗生素desotamides和marformycins，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有L-allo-Ile結(jié)構(gòu)單元。通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，在desotamide和marformycin的生物合成途徑中分別鑒定了一對(duì)由磷酸吡哆醛（pyridoxal5’-phospahte, PLP）依賴(lài)的“氨基轉(zhuǎn)移酶”和新穎異構(gòu)酶（isomerase）組成的酶對(duì)DsaD/DsaE和MfnO/MfnH。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DsaD/DsaE和MfnO/MfnH參與L-allo-Ile結(jié)構(gòu)單元的生物合成，氨基轉(zhuǎn)移酶DsaD/MfnO的敲除使desotamides和marformycins的產(chǎn)量明顯降低，異構(gòu)酶DsaE/MfnH的敲除使突變菌株完全喪失生產(chǎn)含L-allo-Ile結(jié)構(gòu)單元的desotamide和marformycin組分的能力。

　　研究人員在大腸桿菌中對(duì)DsaD/DsaE和MfnO/MfnH分別進(jìn)行了表達(dá)和純化，發(fā)現(xiàn)純化的“氨基轉(zhuǎn)移酶”DsaD/MfnO蛋白溶液呈黃色，紫外掃描提示DsaD/MfnO通過(guò)希夫堿的形式與輔因子PLP共價(jià)相連。體外生化實(shí)驗(yàn)證明，DsaD/DsaE和MfnO/MfnH在不需要添加額外輔因子的條件下可以協(xié)作催化L-Ile和L-allo-Ile間的可逆轉(zhuǎn)化，可逆反應(yīng)平衡常數(shù)為1.37。體外蛋白定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明，氨基轉(zhuǎn)移酶DsaD和MfnO的催化位點(diǎn)分別是其第198位和第206位賴(lài)氨酸殘基，異構(gòu)酶DsaE和MfnH的關(guān)鍵催化位點(diǎn)分別是位于其C-端的第115位和第107位精氨酸殘基。

　　基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了DsaD/DsaE或MfnO/MfnH的可逆協(xié)作催化機(jī)理：底物L(fēng)-Ile首先替換“氨基轉(zhuǎn)移酶”MfnO（或DsaD）與PLP通過(guò)希夫堿的形式形成PLP-L-Ile復(fù)合物；“氨基轉(zhuǎn)移酶”MfnO的Lys206（或DsaD的Lys198）對(duì)PLP-L-Ile復(fù)合物中l(wèi)-Ile的a碳位去質(zhì)子化，形成醌式中間體復(fù)合物；異構(gòu)酶MfnH的Arg107（或DsaE的Arg115）先對(duì)醌式中間體復(fù)合物的b碳位進(jìn)行去質(zhì)子化，形成烯胺中間體復(fù)合物，接著再對(duì)烯胺中間體復(fù)合物的b碳位進(jìn)行重新質(zhì)子化，完成b碳位立體構(gòu)象的改變；MfnO的Lys206（或DsaD的Lys198）對(duì)a碳位重新進(jìn)行質(zhì)子化，獲得產(chǎn)物L(fēng)-allo-Ile；當(dāng)以L-allo-Ile作為底物時(shí)，以上機(jī)理可逆向進(jìn)行。

　　李青連為論文的第一作者，成果得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和“863”計(jì)劃項(xiàng)目的資助。

南海海洋所揭示L-別異亮氨酸的生物合成機(jī)制