展望NGS的下一個(gè)突破點(diǎn)，RNA-Seq和線粒體測(cè)序上榜

　　如今NGS已能夠快速經(jīng)濟(jì)地閱讀數(shù)億個(gè)reads，所及之處遠(yuǎn)超越基因組學(xué)（如RNA測(cè)序使轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)生革命性變化）。盡管NGS取得了諸多進(jìn)步，但依然存在一些重大的挑戰(zhàn)。日前，牛津大學(xué)舉辦的“NGS七周年大會(huì)”聚焦了NGS面臨的挑戰(zhàn)，此次會(huì)議闡述了NGS領(lǐng)域最令人生畏的障礙，同時(shí)也闡述了跨越這些障礙的技術(shù)。
　　
　　本次會(huì)議中提及的NGS的新突破點(diǎn)包括毒性、RNA-Seq文庫(kù)及可變剪接圖譜中的多余轉(zhuǎn)錄組的去除以及線粒體DNA測(cè)序。如今NGS在線粒體DNA測(cè)序領(lǐng)域取得了一定的進(jìn)展，線粒體在疾病發(fā)展中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)，然而這些細(xì)胞器中的DNA測(cè)序十分復(fù)雜，因?yàn)榫€粒體具有相當(dāng)大的遺傳復(fù)雜性和異質(zhì)性。NGS的另一個(gè)突破點(diǎn)為腫瘤異質(zhì)性分析，長(zhǎng)期以來(lái)腫瘤分析都被異質(zhì)性困擾著，但幸運(yùn)的是，異質(zhì)性腫瘤樣本可通過(guò)排序程序?qū)⒉∽兗?xì)胞從總?cè)后w中分離出來(lái)，且這些細(xì)胞群更適合測(cè)序。
　　
　　消除毒性轉(zhuǎn)錄組（ToxicTranscripts）

　　
　　
　　InDA-C技術(shù)效應(yīng)圖
　　
　　創(chuàng)建高特性的RNA-Seq文庫(kù)仍面臨著長(zhǎng)期的挑戰(zhàn)，NuGENTechnologies技術(shù)總監(jiān)LukeSherlin博士說(shuō)，“減少不必要轉(zhuǎn)錄組如rRNA、球蛋白以及其他管家類(lèi)的轉(zhuǎn)錄組，同時(shí)保持總RNA群中的必要轉(zhuǎn)錄組十分有必要。”NuGENTechnologies公司開(kāi)發(fā)了新技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，他們?cè)赗NA-Seq文庫(kù)構(gòu)建的過(guò)程中，利用InDA-C（Insert-DependentAdaptorCleavage）方法（使用特定的酶）來(lái)消除文庫(kù)中多余的轉(zhuǎn)錄組序列，這種方法與雜交捕獲方法形成對(duì)比。“InDA-C是一種靈活的方法，容易應(yīng)用于各種不同的物種如人類(lèi)、小鼠、大鼠、果蠅和擬南芥等”，Sherlin說(shuō)，“InDA-C技術(shù)是一種相對(duì)較新的方法，可提供一種獨(dú)特的方式來(lái)構(gòu)造任何物種的無(wú)偏差的RNA-Seq文庫(kù)，且定制步驟方便簡(jiǎn)單。”
　　
　　可變剪接和RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)
　　
　　RNA-Seq技術(shù)還提供了一個(gè)寶貴的工具來(lái)破譯轉(zhuǎn)錄組的可變剪接。有些基因的一個(gè)mRNA前體通過(guò)不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)）產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，這一過(guò)程稱為可變剪接(或選擇性剪接，alternativesplicing)。可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制，是導(dǎo)致真核生物基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因。
　　
　　霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳醫(yī)學(xué)研究所LilianaFlorea教授表示，“人類(lèi)基因組計(jì)劃10年前創(chuàng)建了剪接變異初始圖譜，但該圖譜仍不完整，仍欠缺包含所有可變剪接的存儲(chǔ)庫(kù)。每個(gè)剪接變異體的編目帶來(lái)的挑戰(zhàn)是令人畏懼的，但RNA-Seq技術(shù)可深入分析細(xì)胞和組織的轉(zhuǎn)錄組，提供一種可詳細(xì)描述可變剪接的技術(shù)手段。但RNA-Seq仍然很難準(zhǔn)確拼湊長(zhǎng)異構(gòu)體所產(chǎn)生的小片段。
　　
　　Florea教授報(bào)告稱，她和她的同事們決定開(kāi)發(fā)適用于RNA-Seq數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，“我們決定開(kāi)發(fā)其他程序無(wú)法達(dá)到的算法來(lái)確定二次變異。”使用這種工具，她希望能夠明確可變剪接是如何發(fā)生以及如何隨細(xì)胞類(lèi)型發(fā)生變化。該研究團(tuán)隊(duì)曾利用Illumina公司的BodyMapdataset建立每個(gè)組織的可變剪接的綜合目錄，該目錄囊括了16個(gè)組織的25億個(gè)序列，被用于不同組織的比較。然而這種比較是一個(gè)艱巨的任務(wù)，為了保持比較的精度，研究人員依賴于內(nèi)部軟件套件SpliceBox，該研究小組發(fā)現(xiàn)，超過(guò)60%的發(fā)現(xiàn)是新的，包括新的外顯子、新的內(nèi)含子等。
　　
　　“這種方法可對(duì)現(xiàn)有的變異注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充，還可為可變剪輯的進(jìn)化和發(fā)展提供新的見(jiàn)解”，F(xiàn)lorea教授強(qiáng)調(diào)，“但更多的RNA-Seq分析需要進(jìn)一步評(píng)估，我們希望更多的實(shí)際應(yīng)用，包括臨床測(cè)序、基本分子生物學(xué)、癌癥研究、甚至包括植物基因組學(xué)。”
　　
　　線粒體DNA測(cè)序
　　

　　異質(zhì)性混合物從母親遺傳給后代
　　
　　線粒體，這些神奇的細(xì)胞體，不僅產(chǎn)生ATP供應(yīng)能量，還與人體罹患癌癥、心臟病和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。西奈山醫(yī)院腫瘤學(xué)教授RaviSachidanadam博士引領(lǐng)的研究證實(shí)了這些觀點(diǎn)。Sachidanadam教授表示，“真核細(xì)胞有兩個(gè)基因組——核DNA（nDNA）和線粒體DNA（mtDNA），雖然線粒體的活性取決于上千個(gè)蛋白質(zhì)，這些蛋白主要由核DNA編碼，但由線粒體DNA編碼的蛋白（大約13個(gè)以上）也扮演了關(guān)鍵的角色。”
　　
　　線粒體DNA測(cè)序不是一件小事，因?yàn)槊總€(gè)線粒體攜帶了多個(gè)線粒體基因組（5-10個(gè)），且每個(gè)細(xì)胞擁有成百上千的線粒體。Sachidanadam博士承認(rèn)，準(zhǔn)確編目線粒體DNA多樣性是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，雖然線粒體DNA豐度不及總DNA的1%，但它在細(xì)胞之間多重復(fù)合，同時(shí)核DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)常被線粒體DNA混淆。
　　
　　為了克服這些挑戰(zhàn)，Sachidanadam博士及其同事開(kāi)發(fā)了一種稱為MSeek的線粒體測(cè)序技術(shù)。Sachidanadam博士說(shuō)，“將線粒體孤立起來(lái)相當(dāng)苦難，我們的方法包括通過(guò)耗盡線性核DNA及廉價(jià)測(cè)序來(lái)凈化線粒體DNA，MSeek可產(chǎn)生高純度的線粒體DNA（>90%），所達(dá)的靈敏度和特異性前所未有，這個(gè)方法是凈化和檢測(cè)線粒體DNA的新方法。”
　　
　　該研究團(tuán)隊(duì)所取的重大突破是確定了核酸外切酶V是消化核DNA的最佳酶，該酶同時(shí)可保持線粒體DNA圓形完好無(wú)損。Sachidanadam博士補(bǔ)充說(shuō)，他們利用Illumina公司的Miseq測(cè)序平臺(tái)來(lái)展開(kāi)這個(gè)試驗(yàn)，并計(jì)算假基因的含量。
　　
　　使用MSeek技術(shù)，該研究團(tuán)隊(duì)得到了一個(gè)驚人的發(fā)現(xiàn)，“我們不僅證實(shí)了異質(zhì)性無(wú)處不在（多個(gè)線粒體DNA單倍體的存在），我們還發(fā)現(xiàn)了異質(zhì)性可作為細(xì)胞類(lèi)型的識(shí)別指紋，此外我們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞之間可互相交換線粒體DNA，這影響了單個(gè)細(xì)胞中線粒體DNA的穩(wěn)定性。”
　　
　　Sachidanadam博士說(shuō)，“我們團(tuán)隊(duì)現(xiàn)研究成果僅僅是MSeek技術(shù)所揭露的一小部分，雖然MSeek技術(shù)目前面臨的局限為所需的DNA總量至少為4ug，我們預(yù)計(jì)該技術(shù)將被應(yīng)用到其他領(lǐng)域中，不僅包括治療，還包括取證等。
　　
　　從FFPE中分離出純的腫瘤細(xì)胞
　　
　　根據(jù)SiliconBiosystems首席商務(wù)官RaimoTanzi博士，腫瘤分析通常因?yàn)楫愘|(zhì)性而存在困擾，數(shù)字分析方法的引進(jìn)，如NGS和數(shù)字PCR可助于梳理少數(shù)的腫瘤樣本，然而只有均質(zhì)抽樣才能提供最清晰的解釋。為了解決這些問(wèn)題，SiliconBiosystems應(yīng)用了新的數(shù)碼技術(shù)（DEPArray™）從異構(gòu)的腫瘤樣本中分離出純細(xì)胞群，該半導(dǎo)體技術(shù)基于在CMOS芯片上利用雙向電泳（DEP）將單細(xì)胞與單級(jí)電泳結(jié)合。
　　
　　Tanzi博士說(shuō)，“FFPE樣本最初先被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞懸濁液，并被給予適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，之后置于一次性的微流控盒中，一旦處于流動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)，每個(gè)細(xì)胞先被CMOS芯片控制電極捕獲，然后被顯微鏡掃描并獲得熒光圖像。根據(jù)這些圖像，每個(gè)細(xì)胞被識(shí)別為特定的類(lèi)型（腫瘤、基質(zhì)等），最終同種類(lèi)型的細(xì)胞純度在100%。”
　　
　　新技術(shù)可將幾十到幾百個(gè)純細(xì)胞從細(xì)胞池中分離出來(lái)并用于全基因組分析。細(xì)胞池中可能包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。Tanzi博士說(shuō)，“DEPArray是第一個(gè)自動(dòng)化技術(shù)可從異構(gòu)的FFPE樣本中分離出純的細(xì)胞，這給許多研究帶來(lái)了好處，其中包括一些與癌癥相關(guān)的研究，如樣品的均勻性、明確識(shí)別拷貝變異數(shù)、雜合子丟失等。該技術(shù)的另一個(gè)可能用途是進(jìn)行非常小的樣本的遺傳分析，包括細(xì)針穿刺標(biāo)本和腫瘤低細(xì)胞結(jié)構(gòu)的遺傳分析。”顯然，研究人員在NGS領(lǐng)域取得了令人興奮的進(jìn)展，未來(lái)應(yīng)該有更快、更精確、更新穎的技術(shù)。
　　
　　提高文庫(kù)制備的性能
　　
　　文庫(kù)制備是NGS的重要部分，成功的測(cè)序需要高質(zhì)量的文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生足夠的收益。由于測(cè)序技術(shù)的提高以及范圍的擴(kuò)大都受文庫(kù)建設(shè)的推動(dòng)。高性能的分析是十分必要的，包括低輸入量以及低質(zhì)量樣本或包含極端CG含量樣本的分析。同時(shí)需要協(xié)議來(lái)保證文庫(kù)的質(zhì)量。新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室研究人員表示他們最近重新研制了NEBNNextUltraDNA工作流程中的試劑配方，為Illumina創(chuàng)建NEBNextUltraIIDNA文庫(kù)制備試劑盒（NEBNextUltraIIDNALibraryPrepKit）。根據(jù)NEBNext開(kāi)發(fā)組組長(zhǎng)EileenDimalanta博士，新的試劑能使客戶克服了文庫(kù)制備面臨的挑戰(zhàn)，如復(fù)雜的樣品類(lèi)型，F(xiàn)FPEDNA、樣本中CG含量的統(tǒng)一以及PCR循環(huán)數(shù)等。