高效液相色譜法及其在藥物分析中的應(yīng)用

摘要：以液體為流動(dòng)相的色譜法稱為液相色譜法。用常壓輸送流動(dòng)相的方法為經(jīng)典液相色譜法，這種色譜法的柱效能低、分離周期長(zhǎng)。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種色譜方法。與經(jīng)典的液相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點(diǎn)：①應(yīng)用了顆粒極細(xì)（一般為10µm以下）、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；②采用高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，一般試樣的分析需數(shù)分鐘，復(fù)雜試樣分析在數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成；③廣泛使用了高靈敏檢測(cè)器，大大提高了靈敏度。目前，已經(jīng)發(fā)展了多種不同的固定相，有多種不同的分離模式，使高效液相色譜法的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。下面介紹高效液相色譜法的有關(guān)知識(shí)，新的方法和技術(shù)以及在藥物分析中的應(yīng)用。

一、分類
    高效液相色譜法按分離機(jī)理的不同可分為以下幾類：
    (一)吸附色譜法（adsorption chromatography）以吸附劑為固定相的色譜方法稱為吸附色譜法。使用最多的吸附色譜固定相是硅膠，流動(dòng)相一般使用一種或多種有機(jī)溶劑的混合溶劑。在吸附色譜中，不同的組分因和固定相吸附力的不同而被分離。組分的極性越大、固定相的吸附力越強(qiáng)，則保留時(shí)間越長(zhǎng)。流動(dòng)相的極性越大，洗脫力越強(qiáng)，則組分的保留時(shí)間越短。
    (二)液-液分配色譜法（liquid- liquid chromatography)液-液分配色譜的固定相和流動(dòng)相是互不相溶的兩種溶劑，分離時(shí)，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數(shù)（K)的不同而被分離。目前廣泛使用的化學(xué)鍵合固定相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上而制成的，使用化學(xué)鍵合固定相的色譜方法（簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法）可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位，是應(yīng)用最廣的色譜法。按照固定相和流動(dòng)相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。
    1.正相色譜法（normal phase chromatography)固定相極性大于流動(dòng)相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法，簡(jiǎn)稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學(xué)鍵合固定相是正相色譜常用的固定相，正相色譜的流動(dòng)相一般為極性較小的有機(jī)溶劑。在正相色譜中，極性小的組分由于K值較小先流出，極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)的分離。
    2.反相色譜法（reversed phase chromatography）流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法，簡(jiǎn)稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相，最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠，還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動(dòng)相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例增加，流動(dòng)相極性減小，洗脫力增強(qiáng)。反相色譜法是目前應(yīng)用最廣的高效液相色譜法。
   (三)離子交換色譜法(ion exchange chromatography)離子對(duì)交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離。柱填料含有極性可離子化的基團(tuán)，如羧酸、磺酸或季銨離子，在合適的PH值下，這些基團(tuán)將解離，吸引相反電荷的物質(zhì)。由于離子型物質(zhì)能與柱填料反應(yīng)，所以可被分離。
樣品中不同的組分因離子交換平衡常數(shù)的不同而分離。離子交換色譜的流動(dòng)相一般為一定PH值的緩沖溶液，有時(shí)也加入少量的有機(jī)溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以增大組分在流動(dòng)相中的溶解度。流動(dòng)相的PH值影響離子交換劑的交換容量。對(duì)弱酸或弱堿性的被分離組分，流動(dòng)相的PH值還會(huì)影響其電離狀況，流動(dòng)相的PH值必須使待分離組分處于離
解狀態(tài)，才能被分離。離子交換色譜法用于分離在測(cè)定條件下呈離解狀態(tài)的組分，如具有酸性或堿性的化合物，反相離子對(duì)色譜法在藥物分析中的應(yīng)用非常廣泛，例如生物堿、磺胺類藥物、某些抗生素及維生素等的分析均可采用此方法。
   (四)空間排斥色譜法（steric exclusion chromatography）空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質(zhì)，即凝膠。被分離組分因分子空間尺寸大小的不同而被分離。當(dāng)組分被流動(dòng)相攜帶進(jìn)入色譜柱時(shí)，體積大的分子不能進(jìn)入固定相表面的孔穴中，而隨流動(dòng)相直接通過(guò)色譜柱，保留時(shí)間最短。體積較小的分子可以進(jìn)入孔穴內(nèi)，在色譜柱中所走的途徑較長(zhǎng)，保留時(shí)間也較長(zhǎng)。分子的尺寸越小，可進(jìn)入的孔穴越多，所走的路徑越長(zhǎng)，保留時(shí)間也越長(zhǎng)。因此，凝膠色譜中，在一定范圍內(nèi)，體積不同的分子保留時(shí)間不同，從而達(dá)到分離的目的。凝膠色譜法主要用來(lái)分離高分子化合物，如蛋白質(zhì)、多糖等。由于分子量和分子體積有關(guān)，凝膠色譜還可以用來(lái)測(cè)定組分的分子量。
   (五)親和色譜法（ligh performance affinity chromatography）親和色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從生物樣品中分離和分析一些特殊物質(zhì)的色譜方法。生物分子之間的專一作用包括抗原與抗體，酶與抑制劑，激素和藥物與細(xì)胞受體，維生素與結(jié)合蛋白，基因與核酸之間的特異親和作用等。親和色譜的固定相是將配基連接于適宜的載體上而制成的，利用樣品中各種物質(zhì)與配基親和力的不同而達(dá)到分離。當(dāng)樣品溶液通過(guò)色譜柱時(shí)，待分離物質(zhì)X與配基L形成X-L復(fù)合物，而被結(jié)合在固定相上，其他物質(zhì)由于與配基無(wú)親和力而直接流出色譜柱，用適宜的流動(dòng)相將結(jié)合的待分離物質(zhì)洗脫，如采用一定濃度的醋酸或氨溶液為流動(dòng)相，減小待分離物質(zhì)與配基的親和力，使復(fù)合物離解，從而將被純化的物質(zhì)洗脫下來(lái)。
HPAC可用于生物活性物質(zhì)的分離、純化和測(cè)定，還可以用來(lái)研究生物體內(nèi)分子間的相互作用及其機(jī)理等。
   (六)手性色譜法（chiral chromatography）不少有機(jī)藥物的結(jié)構(gòu)中有不對(duì)稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋; 光性。立體構(gòu)型不同的一對(duì)對(duì)映體，其藥效、毒副作用往往不相同。例如抗高血壓藥物а-甲基多巴是S-（-）體；又如氯霉素（含有二個(gè)手性碳原子），只有D-（-）異構(gòu)體有效．而L-（+）異構(gòu)體完全無(wú)效。沙利度胺（反應(yīng)停）的兩個(gè)對(duì)映體對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜作用的效價(jià)相近，但只有左旋異構(gòu)體才有胚胎毒及致畸作用。因此，對(duì)映體的分離，在藥物的制備和質(zhì)量控制方面，都具有重要的意義。對(duì)映體在普通條件下的理化性質(zhì)是相同的，因此分離對(duì)映體需要在手性條件下進(jìn)行。分離對(duì)映體的色譜方法稱為手性色譜法。手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對(duì)映體與一定的手性衍生化試劑反應(yīng)，使其由對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映體，再利用他們理化性質(zhì)的差異，用一般的色譜條件進(jìn)行分離。直接法不需作衍生化反應(yīng)，直接利用手性色譜柱或手性流動(dòng)相進(jìn)行分離，應(yīng)用較多，以下主要介紹直接法。
   1.手性固定相（chiral stationary Phase，CSP）手性藥物拆分前的對(duì)映體通常以鏡象存在，即以外消旋體形式存在。用常規(guī)分析和制備方法不能將其拆分，需引入不對(duì)稱（即手性）環(huán)境，使欲拆分的對(duì)映體（樣品）、手性作用物（比如固定相）和手性源形成一個(gè)非對(duì)映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。為了形成這樣一種分子絡(luò)合物，分子之間要有一種同時(shí)相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。Dalgliesh認(rèn)為至少要有三個(gè)作用力，其中一個(gè)要有立體選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點(diǎn)相互作用”理論。如果對(duì)映體中某一種對(duì)映體正好與此三個(gè)作用點(diǎn)配對(duì)，相互作用較強(qiáng)，保留時(shí)間就長(zhǎng)。而另一種對(duì)映體因空間構(gòu)型不同，不能完全配對(duì)，作用相對(duì)較弱，保留時(shí)間就短，從而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。
   l.1常用的手性固定相有以下幾種。
    (1) Pirkle型手性固定相
Pickle型手性固定相是由美國(guó)學(xué)者Pirkle主持研制的，主要有π-堿性（斥電子基）手性固定相和π-酸性（吸電子基）手性固定相。在分離的過(guò)程中，化合物與固定相之間發(fā)生π-π電荷轉(zhuǎn)移相互作用，此類固定相為電荷轉(zhuǎn)移型手性固定相。
    (2) 蛋白質(zhì)類手性因定相
蛋白質(zhì)是由手性亞基團(tuán)氨基酸組成的大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)類手性固定相是將蛋白質(zhì)通過(guò)氨基酸鍵合到硅膠上而制成的。常用的蛋白質(zhì)類手性固定相有牛血清蛋白（RSA）和人血a1-酸性糖蛋白（AGP）的手性固定相，商品有Chiral AGP，Resolvosil， Enantio Pac等。
蛋白質(zhì)類手性固定相應(yīng)用范圍較廣，效果良好，但該類固定相的譜柱容量較小。常用洗脫系統(tǒng)是磷酸鹽緩沖溶液（PH4～7），離子強(qiáng)度為0～500mmol，有機(jī)改性劑不得超過(guò)5%。用蛋白質(zhì)類手性固定相拆分酸性和堿性傾倒物對(duì)映體時(shí)，流動(dòng)相內(nèi)可分別加少量離子對(duì)試劑，如N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結(jié)果。
    (3)多糖類手性固定相
多糖類手性固定相中應(yīng)用最多的是環(huán)糊精。環(huán)糊精（cyclodextrin, CD)是一類環(huán)形寡聚糖，為手性高分子物質(zhì)，。根據(jù)分子中葡萄糖單元的個(gè)數(shù)不同，環(huán)糊精可分為α、β、γ三類，他們分別由6、7、8個(gè)D-吡喃葡萄糖組成，將CD分別通過(guò)硅烷鏈連接在硅膠表面就構(gòu)成環(huán)糊精手性固定相。環(huán)糊精分子成錐桶狀，內(nèi)腔的直徑由組成環(huán)糊精的葡萄糖個(gè)數(shù)決定，如常用的β-環(huán)糊精由7個(gè)葡萄糖分子組成，內(nèi)腔直徑為0.8nm。
用環(huán)糊精手性固定相進(jìn)行分離時(shí)，首先要求被拆分的組分進(jìn)人洞穴，形成包合物，保留時(shí)間以組分能否進(jìn)人洞穴及其緊密的程度而定，環(huán)糊精環(huán)上還有多個(gè)手性中心，能選擇性地; 與對(duì)映體作用，從而導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體的保留不同而被分離。如用β-環(huán)糊精手性固定相已經(jīng)成功地分離了二茂鐵等金屬有機(jī)絡(luò)合物、氨基酸以及生物堿等。
除環(huán)糊精外，多糖類的手性固定相還可以用纖維素、直鏈淀粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。
    (4)冠醚（Grown ether）類手性固定相
冠醚與環(huán)糊精類似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環(huán)狀化合物，呈王冠狀結(jié)構(gòu)，外層是親脂性的乙撐基，環(huán)的內(nèi)層是富電子的雜原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙煒骨架或硅膠上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分離對(duì)映體時(shí)，不同對(duì)映異構(gòu)體因與冠醚環(huán)腔形成的主客體絡(luò)合物的穩(wěn)定性不同而被分離。在冠醚上引人雙萘基，雙萘基可以形成“手性墻”，增加固定相的立體選擇性。能質(zhì)子化的氨基化合物，特別是氨基酸對(duì)映體在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。
除以上手性固定相外，還有模擬酶手性固定相、配位交換手性固定相等。
   2.手性流動(dòng)相（chiral mobile phase ，CMP）拆分法
手性流動(dòng)相拆分法是將手性試劑添加到流動(dòng)相中，利用手性試劑與對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)不同或結(jié)合物在固定相上分配的差異進(jìn)行分離。近年來(lái)，手性流動(dòng)相拆分法已廣泛應(yīng)用于藥物對(duì)映體的拆分。此法的最大優(yōu)勢(shì)在于：可采用普通的非手性固定相，不需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更換，同時(shí)添加物的可變范圍較寬，穩(wěn)定性好，且價(jià)格便宜。
    (1) 配體交換型手性添加劑
配體交換型手性添加劑由手性配基和含二價(jià)金屬離子的鹽組成。手性配基多為具有光學(xué)活性的氨基酸及其衍生物，他們和二價(jià)金屬離子螯合，分布于流動(dòng)相中，遇到待分離的對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，即形成配合物，再在流動(dòng)相和固定相之間分配而實(shí)現(xiàn)分離。分離的機(jī)理一般認(rèn)為是配基和金屬離子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成動(dòng)態(tài)的手性固定相而發(fā)揮作用。也可以看成是手性配基、金屬離子和對(duì)映異構(gòu)體形成的配合物穩(wěn)定常數(shù)不同而產(chǎn)生分離。采用5µm粒徑的C18 固定相，阿司帕坦作為CMPA，與硫酸銅絡(luò)合，測(cè)定高血溶素患者
尿中D-和L-2-哌啶酸的濃度。
    (2)環(huán)糊精添加劑
環(huán)糊精在水中有一定的溶解度，用環(huán)糊精作為手性添加劑，加入流動(dòng)相中，其分離機(jī)理與環(huán)糊精手性固定相相同，但保留行為正好相反。對(duì)映異構(gòu)體與環(huán)糊精形成的包合物穩(wěn)定性越強(qiáng)，隨流動(dòng)相出柱越快，保留時(shí)間越短。
    (3) 手性離于對(duì)添加劑
解離的有機(jī)化合物能與含互補(bǔ)電荷的試劑相互作用，生成電中性離子對(duì)。分離帶電荷的對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，可以在流動(dòng)相中添加手性的離子對(duì)試劑，對(duì)映異構(gòu)體和離子對(duì)試劑形成電中性的離子對(duì)，離子對(duì)在固定相和流動(dòng)相間分配系數(shù)不同而得到分離。常用的手性離子對(duì)試劑有（＋）10-樟腦磺酸、奎寧等。

二、高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)等組成。
   (一)輸液泵
    高效液相色譜的流動(dòng)相采用高壓泵輸送，有不同類型的輸液泵，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。目前使用較多的是柱塞式往復(fù)泵，柱塞式往復(fù)泵為恒流泵，可按設(shè)定的流速輸送流動(dòng)相，流量不受柱阻力的影響，可保持恒定，并容易清洗和更換。由于柱塞式往復(fù)泵是通過(guò)柱塞的往復(fù)運(yùn)動(dòng)來(lái)關(guān)液的，所以輸液的脈動(dòng)性較大。目前多采用雙泵補(bǔ)償?shù)姆椒p小脈動(dòng)性。雙泵補(bǔ)償是同時(shí)使用兩個(gè)泵進(jìn)行工作，兩個(gè)泵可以按串聯(lián)或并聯(lián)方式連拉，交替送液，相互補(bǔ)償，達(dá)到減小脈動(dòng)的目的。
   (二)進(jìn)樣器
    進(jìn)樣器是將試樣送入色譜柱的裝置。一般要求進(jìn)樣裝置的密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。有進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣裝置兩種。除使用自動(dòng)進(jìn)樣裝置外，用手工進(jìn)樣均使用六通進(jìn)樣閥。在工作狀態(tài)下，儀器系統(tǒng)內(nèi)處于高壓的狀態(tài)，借助于六通進(jìn)樣閥，實(shí)現(xiàn)了常壓下不停流進(jìn)樣。
    六通進(jìn)樣閥可分為定子和轉(zhuǎn)子兩部分，共有6個(gè)口，故稱為六通進(jìn)樣閥。轉(zhuǎn)子通過(guò)扳手調(diào)節(jié)，可以分別處于“裝樣”和“進(jìn)樣”兩個(gè)位置。當(dāng)將扳手扳至“進(jìn)樣”位時(shí)，進(jìn)樣閥的流路發(fā)生了改變，流動(dòng)相通過(guò)樣品管，將注入的樣品帶入色譜柱進(jìn)行分析。六通進(jìn)樣閥具有使用方便，進(jìn)樣量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。樣品環(huán)有10µl、20µl、50µl等不同容積，可以選配。樣品環(huán)不僅可以用來(lái)貯液，也可用來(lái)測(cè)量樣品溶液的體積。將樣品環(huán)裝滿后，進(jìn)樣，進(jìn)樣量即為樣品環(huán)的容積，此種進(jìn)樣方式稱為“滿環(huán)進(jìn)樣”或“定量環(huán)進(jìn)樣”。用定量環(huán)進(jìn)樣精密度好，在使用外標(biāo)法時(shí)，應(yīng)使用此種操作方式。
   (三)色譜柱色譜柱是色譜分離的核心。為了保證色譜柱的柱效高，使用壽命長(zhǎng)，一般使用由專業(yè)化工廠生產(chǎn)的商品柱。色譜柱管多由不銹鋼制成，內(nèi)裝一定的固定相。色譜往長(zhǎng)一般10～30cm，內(nèi)徑2～5mm。
    化學(xué)鍵合相是廣泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilyl silicagel，ODS）的應(yīng)用最為廣泛，ODS為非極性化學(xué)健合相，此外還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等，非極性化學(xué)健合相用于反相色譜法。中等極性的化學(xué)鍵合相有苯基化學(xué)鍵合相等，氰基化學(xué)鍵合相和氨基化學(xué)鍵合相是常用的極性化學(xué)鍵合相，極性的化學(xué)鍵合相一般用于正相色譜法。吸附色譜的固定相中使用最多的是硅膠。無(wú)論自己填裝的色譜柱還是購(gòu)買(mǎi)的商品柱，使用能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下的柱壓、理論塔板高度和理論塔板數(shù)、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性等。
   (四)檢測(cè)器樣品經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入檢側(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。按其適用范圍檢測(cè)器可分為通用型和專屬型兩大類，專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，紫外檢測(cè)器(UVD），熒光檢測(cè)器（ED）屬于這一類，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)；通用型檢測(cè)器檢測(cè)的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，示差折光檢測(cè)器（RID），蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD)等。
   液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)則是用質(zhì)譜作為高效液相色譜的檢測(cè)器。
   1.紫外檢測(cè)器
    (1)普通紫外檢測(cè)器
    紫外檢測(cè)器是高效液相色譜中應(yīng)用最廣的一種檢測(cè)器。用一定波長(zhǎng)的單色光照射流通池，流動(dòng)相攜帶被分離的組分進(jìn)入流通池時(shí)，流動(dòng)相在測(cè)定波長(zhǎng)處不吸收光或吸收很弱，測(cè)定組分在該波長(zhǎng)處有很強(qiáng)的吸收，記錄不同時(shí)間對(duì)光的吸收度，就得到一張色譜圖。組分對(duì)光的吸收符合Iambert-beer定律，因此色譜峰的面積和組分的量成正比關(guān)系。紫外檢測(cè)器的特點(diǎn)是靈敏度高，線性范圍寬，對(duì)溫度和流動(dòng)相的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。但紫外檢測(cè)器只能檢測(cè)具有紫外吸收的組分，像糖類、脂肪酸類等在測(cè)定范圍內(nèi)無(wú)紫外吸收的組分不能檢側(cè)。用普通紫外檢側(cè)器也不便測(cè)定流出組分的紫外吸收光譜，有的紫外檢測(cè)器雖可測(cè)定紫外吸收光譜，但在組分到達(dá)檢測(cè)器時(shí)需停流，再掃描。
   (2) 光二極管陣列檢瀏器(photodiode array detector，PDAD）
光二極管陣列檢測(cè)器是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測(cè)器，它可以在瞬間完成對(duì)組分的紫外掃描。
    由光源發(fā)射的光照射流通池，被組分選擇性地吸收，透過(guò)光通過(guò)光柵分光，形成組分的紫外吸收光譜，照射在成矩陣排列的光二極管上，光二極管將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，輸出的電信號(hào)與光的強(qiáng)度成正比，電信號(hào)經(jīng)過(guò)累加、處理，就可以得到組分的紫外吸收光譜。因此，使用PDAD，可以在瞬間獲得組分的紫外吸收光譜，而不需停流進(jìn)行紫外掃描。光二極管的個(gè)數(shù)越多，圖譜的分辨率越高，若有512個(gè)光二極管，在190～800nm范圍內(nèi)掃描，則平均每1.2nm對(duì)應(yīng)一個(gè)光二極管。
用PDAD按設(shè)定的時(shí)間間隔采集數(shù)據(jù)，可以得到一張三維的光譜-色譜圖。吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量。應(yīng)用三維圖譜還可以對(duì)峰的純度進(jìn)行檢查。若一個(gè)色譜峰包含有兩個(gè)組分，則不同位置的紫外吸收光譜會(huì)有差異通過(guò)比較色譜峰不同位置紫外光譜圖的一致性，可以進(jìn)行色譜峰的純度檢查。
   2．熒光檢測(cè)器
熒光檢測(cè)器是利用組分發(fā)出的熒光進(jìn)行檢測(cè)的方法。熒光檢測(cè)器的靈敏度比紫外檢測(cè)器高，檢測(cè)限可以達(dá)到1×10-10g/ml，但組分必須有熒光。許多藥物和生物活性物質(zhì)具有天然熒光，能直接檢測(cè)，如生物胺、維生素和甾體化合物搶救無(wú)效；通過(guò)熒光衍生化可以使本來(lái)沒(méi)有熒光的化合物轉(zhuǎn)變成熒光衍生物，從而擴(kuò)大了熒光檢測(cè)器的應(yīng)用范圍，例如氨基酸。由于熒光檢測(cè)器的高靈敏度和選擇性，它是體內(nèi)藥物分析常用的檢測(cè)器之一。
   3．蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是在90年代出現(xiàn)的一種新型的通用型檢測(cè)器，主要適用于無(wú)紫外吸收，不能用紫外檢測(cè)的組分，如糖類、脂肪酸、甘油三酯及甾體等。
ELSD的檢測(cè)可分為三個(gè)步驟。
   (1)霧化在霧化器中，洗脫液通過(guò)1個(gè)針孔與氮?dú)猓ㄒ部梢杂每諝猓┗旌?，形成均勻的霧狀液滴。
   (2）流動(dòng)相蒸發(fā)液滴通過(guò)加熱的漂移管時(shí)，流動(dòng)相被蒸發(fā)，樣品組分形成氣溶膠，進(jìn)人檢測(cè)室。
   (3）檢測(cè)在檢測(cè)室內(nèi)，用激光來(lái)照射氣溶膠，產(chǎn)生散射，測(cè)定散射光強(qiáng)，記錄散射光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化關(guān)系，就得到了色譜圖。
    氣溶膠受固定光強(qiáng)的激光照射后，待測(cè)組分的質(zhì)量(m）和散射光強(qiáng)度(I)有以下的關(guān)系I=Kmb; lgI=blgm+lgK式中K和b為與蒸發(fā)室溫度和流動(dòng)相性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)。上式說(shuō)明散射光的對(duì)數(shù)響應(yīng)值與組分的質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。
    ELSD用來(lái)測(cè)定那些不能用紫外檢側(cè)器檢側(cè)的組分，對(duì)HM的檢測(cè)器是很重要的補(bǔ)充。但ELSD對(duì)有紫外吸收的組分檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低．此外，它只適合流動(dòng)相能完全揮發(fā)的色譜條件，若流動(dòng)相含有難以揮發(fā)的緩沖劑時(shí)，就不能用ELSD進(jìn)行檢測(cè)。
   4.液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC- MS）是用質(zhì)譜作為HPLC的檢測(cè)器，它將HPLC的高分離效能和質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性、通用性及較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)解析能力相結(jié)合，成為藥品質(zhì)量控制、體內(nèi)藥物分析和藥物代謝研究的最重要的手段。由于質(zhì)譜的工作系統(tǒng)是處于真空狀態(tài)的，若將液相色譜的流出液直接引人質(zhì)譜儀，流出液揮發(fā)產(chǎn)生的大量氣體，會(huì)使質(zhì)譜儀無(wú)法正常工作。因此，LC-MS的關(guān)鍵是接口，目前應(yīng)用較多的接口有以下幾種。
   (1)粒子束（PB）接口使用粒子束接口時(shí)，來(lái)自HPLC的洗脫液經(jīng)霧化器霧化，變成氣溶膠微粒，霧化的工作氣體是氦氣。溶劑在脫溶劑室被蒸發(fā)，再進(jìn)入動(dòng)量分離器，在動(dòng)量分離器內(nèi)由于溶劑和測(cè)定組分的質(zhì)量有很大差別，二者之間會(huì)出現(xiàn)動(dòng)量差，動(dòng)量較小的溶劑和噴射氣體（氦氣）被抽氣泵抽走，測(cè)定組分則沿傳輸管進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子源。使用粒子束接口時(shí)，可使用EI（電子轟擊離子源）或CI（化學(xué)離子源），因而可以得到經(jīng)典的質(zhì)譜圖，并可以使用圖譜庫(kù)檢索，對(duì)未知樣品的分析非常有用，但不適用于對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物的分析。
   (2)熱噴霧接口（TSP)熱噴霧接口是在液態(tài)下將樣品分子離子化的方法。流動(dòng)相在經(jīng)過(guò)噴霧探針時(shí)被加熱，體積膨脹后以超聲速噴出探針，形成霧滴。液滴在離開(kāi)噴嘴時(shí)由于統(tǒng)計(jì)漲落分別帶上多余的正電荷或負(fù)電荷，當(dāng)它在運(yùn)動(dòng)中不斷失去溶劑，液滴的半徑足夠小時(shí)，表面電荷形成很強(qiáng)的電場(chǎng)，導(dǎo)致組分離解。也可以采用熱燈絲發(fā)射電子束轟擊溶劑和測(cè)定組引發(fā)化學(xué)電離。TSP適用于含水比例較高、流速較高(1ml/min～ 2ml/min）以及極性較大的測(cè)定組分的分析。
   (3)大氣壓離子化（API）接口大氣壓離子化接口是指離子化在常壓下進(jìn)行的接口，API是目前LS-MS中應(yīng)用最廣的接口。API有電噴霧(ESP)、離子噴霧(ISP)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)三種操作模式。
   (五)數(shù)據(jù)記錄處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
    現(xiàn)代HPLC的的特征是用微機(jī)控制儀器。HPLC儀器的中心計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，即能做數(shù)據(jù)采集和分析工作，又能程序控制儀器的各個(gè)部件，還能在分析一個(gè)試樣之后自動(dòng)改變條件而進(jìn)行下一個(gè)試樣的分析，許多色譜儀的軟件系統(tǒng)具有方法認(rèn)證功能，使分析工作更加規(guī)范化。

三、在藥物分析中的應(yīng)用;高效液相色譜法分離效能高，應(yīng)用范圍廣，靈敏度高，儀器已較成熟、普及，在新藥的研究開(kāi)發(fā)，藥品檢驗(yàn)，生物樣品的分析中應(yīng)用十分廣泛。
   (一)色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
    由于色譜分離的效果受色譜柱的狀況，流動(dòng)相組成等因素的影響很大，為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確，中國(guó)藥典規(guī)定，在進(jìn)行色譜分析前需檢查色譜系統(tǒng)是否正常，是否符合要求，即需要作色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的內(nèi)容有：
   1. 色譜柱的理論板數(shù)
在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液記錄色譜圖，量出測(cè)定組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR和半高峰寬（Wh/2），按下式計(jì)算色譜往的理論板數(shù)：;n=5.54(tR/Wh/2)2如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)更換色譜柱或其他條件使理論板數(shù)達(dá)到要求。色譜柱的理論板數(shù)主要取決于半高峰寬Wh/2，在一定的條件下，wh/2越窄，理論板數(shù)越高，相鄰峰的分離越好。
   2.分離度（R)
分離度用來(lái)表示相鄰兩峰分離的程度。分離度（R）的計(jì)算公式為：2(tR2―tR1);R=;
W1+W2除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。當(dāng)分離度大于1.5時(shí)，相鄰兩峰達(dá)到了完全分離。
   3. 重復(fù)性
取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。
   4. 拖尾因子（T)
拖尾因子用來(lái)表示峰的對(duì)稱性。為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確，特別當(dāng)采用峰高法定量時(shí)，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，拖尾因子計(jì)算公式為W0.05hT= 2d1除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95～1.05之間。
   (二)在藥物分析中的應(yīng)用
   1.在鑒別中的應(yīng)用
    在HPLC法中，保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，是定性的參數(shù)，可用于藥物的鑒別。如中國(guó)藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定：在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品主峰的保留時(shí)間一致。頭抱拉定、頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別。
   2.在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用
    HPLC分離效能高，靈敏，在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛。主要用于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查。“有關(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似，含量很低，只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測(cè)。若雜質(zhì)是已知的，又有雜質(zhì)的對(duì)照品，可用雜質(zhì)對(duì)照品做對(duì)照進(jìn)行檢查。若雜質(zhì)是未知的，可以采用主成分自身對(duì)照法或峰面積歸一化法進(jìn)行檢查。
   3．在含量測(cè)定中的應(yīng)用
用高效液相色譜法側(cè)定含量可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存的藥物對(duì)測(cè)定的干擾。中藥材及其制劑組成復(fù)雜，基中不少有效成分的含量測(cè)定也越來(lái)越多地采用了高效液相色譜法。
   4.手性分離
   5.在藥濃檢側(cè)中的應(yīng)用
    示例：對(duì)乙酰氨基酚急性中毒的血藥濃度檢測(cè)分析對(duì)乙酰氨基酚是臨床上使用極其廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥。由于患者狀態(tài)的多樣性以及對(duì)酰氨基酚中毒的早期癥狀與胃潰瘍癥狀極其相似且肝功正常，故常常發(fā)生漏診，等到發(fā)生肝損傷已經(jīng)錯(cuò)過(guò)了治療最佳時(shí)機(jī)。因此，國(guó)外已將對(duì)乙酰氨其酚血濃度作為急診中毒病人常規(guī)檢測(cè)。色譜條件：采用Nova-PakC18柱（4µm,150mm×3.9mm），柱溫25℃；流動(dòng)相為甲醇-水（30:30），流速為0.8ml/min；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。血漿樣品制備; 取靜脈血3ml～4ml，置含肝素抗凝劑的離心管中，離心分離5min（3000r/min），上清液為待測(cè)血漿。取上述血漿1ml，加飽和硫酸鋅溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，渦漩混合1min，離心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50℃氮?dú)饬鞔蹈桑渲潦覝?，以蒸餾水500µl溶解殘?jiān)?0µl進(jìn)樣。對(duì)照品溶液制備; 配制對(duì)乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為0.01mg/ml～5mg/ml的對(duì)照品溶液，4℃冰箱存放備用。血漿中對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制備; 取肝素抗凝的血漿1ml，分別加入不同濃度的對(duì)乙酰氨基酚工作液100µl，使血漿中藥物濃度為0.9µg/ml～454.5µg/ml，再按“血漿樣品制備”項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖，以溶液C對(duì)峰面積A作線性回歸，得回歸方程：A=1.64×104+1.68×107C，R=0.9995，線性范圍為0.9µg/ml～454.5µg/ml，最低檢測(cè)濃度為0.9µg/ml(以信噪比≥3計(jì))。用HPLC測(cè)定可疑中毒病人血中對(duì)乙酰氨基酚濃度具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，可有效地幫助臨床醫(yī)生確診，快速有效地救治患者，對(duì)提高醫(yī)療質(zhì)量有重要意義。液、組織中藥物的濃度，在藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究、臨床血藥濃度檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛。